Induktion av Alloantigen-specifika anergi på humana perifera mononukleära blodceller genom Alloantigen stimulering med Co-stimulerande signal Blockade

Summary

Detta dokument beskriver en enkel teknik för att inducera alloantigen-specifika anergi i humana perifera mononukleära blodceller. Tekniken kan användas kliniskt för att generera icke-alloreactive donator celler. Infusion av dessa celler skulle kunna förbättra immunförsvaret beredning och minska toxicitet efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation.

Abstract

Allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (AHSCT) erbjuder den bästa chansen att bota många patienter med medfödda och förvärvade hematologiska sjukdomar. Tyvärr kan transplantation av alloreactive celler givare T som erkänner och skada frisk patient vävnader resultera i Graft-versus-Host Disease (GvHD) ^1. En utmaning till framgångsrika AHSCT är att förebygga GvHD utan tillhörande försämring av de gynnsamma effekterna av celler givare T, särskilt immunförsvaret beredning och förebyggande av återfall. GvHD kan förebyggas genom icke-specifika utarmning av donator T-celler från transplantat stamceller eller genom tillförsel av farmakologiska immunsuppression. Tyvärr har dessa metoder ökar infektioner och sjukdomar återfall ^2-4. En alternativ strategi är att selektivt bryter alloreactive celler donator T efter allostimulation genom att presentera mottagaren antigen celler (APC) innan transplantation. Tidiga kliniska prövningar av dessa allodepletion strategier bättre immunförsvar beredning efter HLA-inkompatibla HSCT utan överdrifter GvHD ^{5, 6.} Men vissa allodepletion tekniker kräver speciella mottagare APC produktion ^{6, 7} och vissa metoder kan ha off-target effekter inklusive utarmning av givare patogenspecifika T-celler ⁸ och CD4 T reglerande celler ^9. Ett alternativ är att inaktivera alloreactive celler givare T via induktion av alloantigen-specifika hyporesponsiv. Detta uppnås genom att stimulera donator celler med mottagaren APC samtidigt som blockaden av CD28-medierad co-stimulering signaler ^10. Denna "alloanergization"-metod minskar alloreactivity med 1-2 stockar samtidigt patogen-och tumör-associerade antigen reaktioner T cells in ^vitro-11 . Strategin har varit framgångsrik anställd i 2 avslutad och en pågående kliniska pilotstudier där alloanergized donator T-celler var infunderas under eller efter HLA-inkompatibla HSCT resulterar i snabb immunförsvaret beredning få infektioner och mindre allvarliga akut och kronisk GvHD än historiska kontroller mottagare av unmanipulated HLA-inkompatibla transplantationer ^12. Här beskriver vi vår nuvarande protokollet för generering av perifera mononukleära blodceller (PBMC) som har alloanergized mot HLA-inkompatibla orelaterade stimulator PBMC. Alloanergization uppnås genom allostimulation i närvaro av monoklonala antikroppar mot ligander B7.1 och B7.1 för att blockera CD28-medierad costimulation. Denna teknik kräver inte att produktionen av specialiserad stimulator APC och är enkel att utföra, kräver endast en enkel och relativt korta ex steg vivo inkubation. Som sådan kan den metod lätt standardiserade för klinisk användning för att generera celler donator T med reducerad alloreactivity men behåller patogen-specifik immunitet för adoptiv transfer i fastställandet av AHSCT att förbättra immunförsvaret beredning utan alltför GvHD.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Beredning av PBMC</p><ol><li> Rutiner för god aseptisk teknik och universella försiktighetsåtgärder måste följas under genomförandet av detta protokoll.</li><li> Isolera PBMC från friska frivilliga givare av densitetsgradient centrifugering med Ficoll-Hypaque. Alternativt frysförvarade PBMC kan återupplivas.</li><li> Räkna livskraftiga PBMC efter färgning med Trypan Blå med en hemocytometer. Resuspendera PBMC helt odlingsmedia (CM) vid en koncentration på 1 miljon livskraftiga celler / ml i en 15 ml Falcon rör.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Ställa in Bulk Alloanergizing Co-kulturen</p><ol><li> PBMC från två separata donatorer behövs för att ställa in alloanergization kulturer. Celler från en givare kommer att tjäna som responders och celler från en annan givare kommer att fungera som stimulatorn (sk First Party stimulator).</li><li> Plats 10 miljoner stimulatorn PBMC vid 1 miljon / ml i 15 ml Falcon rör och tillsätt 100 mg av anti-B7.1 och 100mg av anti B7.2 antikroppar för att blockera costimulation. Skaka försiktigt röret och inkubera i 30 minuter. Inkubation förutsättningar för detta och alla efterföljande steg är 37 ° C / 5% CO₂ / 80% luftfuktighet</li><li> Bestråla stimulatorn PBMC (3,3 Gy) och lägga till en T-25 50cm³ Cellodling kolv med en gas-genomsläppliga mössa. Märk kolven "Bulk alloanergizing co-kultur".</li><li> Lägg till 10 mL responder PBMC (vid 1 miljon / ml i CM) till kolven.</li><li> Tillsätt ytterligare 100mg var och en av anti-B7.1 och anti B7.2 antikroppar och blanda försiktigt före placera kolven upprätt i en inkubator för 72 timmar</li></ol><p class="jove_title"> 3. Inställning av Bulk Kontroll Co-kulturen</p><ol><li> Plats 10 miljoner stimulator PBMC (vid 1 miljon / ml) i en 15 ml Falcon rör.</li><li> Bestråla 10 miljoner stimulator PBMC (3,3 Gy). Och lägga till en 50cm³ Cellodling kolv. Label "Bulk kontroll co-kultur".</li><li> Lägg till 10 mL responder PBMC vid 1 miljon / ml i CM till kolven och blanda försiktigt före placera kolven upprätt i en inkubator för 72 timmar.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Installera den primära Mixed Lymphocyte Reaktion (MLR) för att mäta effekten hos samtidigt stimulerande Blockade</p><ol><li> Effekten av co-stimulerande blockad mäts i en primär MLR som konfigureras med PBMC från huvudavgasflödet alloanergizing och kontroll co-kulturer</li><li> Den primära MLR är inställd på samma dag att merparten kulturer har satts upp</li><li> Första etiketten ett U-botten 96 brunnar "Primär MLR" för varje av de tre tidpunkter som ska mätas (Dag 4, 5 och 6 efter plattor sätts upp).</li><li> Häll 5 ml från varje bulk kontroll och alloanergizing co-kulturer i 15ml Falcon rör.</li><li> Pipettera 200 ml cellsuspension från varje Falcon röret i tre exemplar brunnar på varje platta. Label dessa brunnar "ingen co-stimulerande blockad (CSB)" för celler från huvuddelen kontroll co-kulturer och "CSB" för celler från huvuddelen alloanergizing co-kulturer</li><li> Lägg till 200ml av CM till 6 brunnar på varje platta som negativa kontroller. 200ml PBS läggs på alla tomma brunnar för att minska avdunstningen. Placera plattorna i inkubatorn.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Installera den sekundära MLR att mäta effektiviteten av Alloanergization</p><ol><li> 72 timmar efter att du installerat bulk co-kulturer, resterande alloresponses i alloanergized PBMC mäts i en sekundär MLR. I den sekundära MLR, PBMC från både bulk alloanergizing co-kulturen och den största delen kontroll co-kultur tvättas och restimulated med bestrålade allostimulator PBMC</li><li> För att ställa in den sekundära MLR etiketten ett U-botten 96 brunnar "Sekundär MLR" för varje av de tre tidpunkter som ska mätas (Dag 3, 5 och 7 efter att ställa upp).</li><li> Ta bort 5 ml från varje bulk kontroll och alloanergizing co-kulturer, överföring till 15ml Falcon rör och centrifugera i 5-10 minuter vid 2000 rpm.Aspirate supernatanten försiktigt, störa pelleten, lägga 10mL av CM och centrifugera cellerna igen. Upprepa detta tvättsteg.</li><li> Resuspendera cellerna i 1 mL CM. Räkna livsdugliga celler med hjälp Trypan blå färgning och justera cellkoncentrationen till 1 miljon livskraftiga responder celler / ml.</li><li> Pipettera 100 ml cellsuspension från varje Falcon röret i tre exemplar brunnar på varje platta. Label dessa brunnar "First Party (FP) allorestimulation"</li><li> Pipettera 100 ml cellsuspension från varje Falcon röret i ytterligare 3 brunnar på varje platta och etikett dessa brunnar "CD3/28 stimulans"</li><li> För att förbereda stimulatorn celler för de sekundära MLR, isolera PBMC från färskt blod (eller återuppväcka frysförvarade PBMC) från samma friska givare som används för att leverera first PBMC parti stimulatorn i alloanergizing och kulturer kontroll.</li><li> Häng PBMC från ramprogrammet givare vid en koncentration på 1 miljon / ml och bestråla (3.3Gy)</li><li> Lägg till 100 mL av bestrålat stimulator celler i brunnarna med etiketten "FP allorestimulation"</li><li> För positiva kontroller, tillsätt 1 ml vardera av CD3 och CD28 monoklonala antikroppar och 98mL av CM i brunnarna med etiketten "CD3/28 stimulans". Tillsätt 200 ml CM 6 brunnar på varje platta som negativ kontroll och 200ml PBS att tömma brunnar. Placera plattorna i inkubatorn.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Mätning av specificitet Alloanergization</p><ol><li> Specificiteten för alloanergization bestäms genom att jämföra spridningen av responder celler tas från den avslutade alloanergizing och kontroll co-kulturer efter stimulering med bestrålade PBMC från en "tredje part" frisk givare (dvs. en annan givare till First Party) i en sekundär MLR.</li><li> Label tre 96 brunnar "Sekundär MLR specificitet" Dag 3, 5 och 7.</li><li> Ta bort 5 ml från varje bulk kontroll och alloanergizing co-kulturer överföring till 15ml Falcon rör och centrifugera i 5-10 minuter vid 2000 rpm. Aspirera supernatanten försiktigt, störa pelleten, lägga 10mL av CM och centrifugera cellerna igen. Upprepa detta tvättsteg.</li><li> Resuspendera cellerna i 1 mL CM. räkna med Trypan blå färgning och justera cellkoncentrationen till 1 miljon livskraftiga responder celler / ml.</li><li> Att förbereda third celler man stimulator för sekundära MLR, isolera PBMC från färskt blod (eller återuppväcka frysförvarade PBMC) från en ny frisk donator. Pipettera 100 ml cellsuspension från varje Falcon röret i tre exemplar brunnar på varje platta. Label dessa brunnar "TP allostimulation"</li><li> Häng PBMC från en TP-givare till 1 miljon / ml och bestråla (3,3 Gy)</li><li> Lägg till 200ml av bestrålat TP stimulator celler i brunnarna märkt "TP allostimulation"</li><li> Specificitet alloanergization kan också bestämmas genom att jämföra spridningen av responder celler tas från den avslutade alloanergizing och kontroll co-kulturer efter stimulering med en smittsam patogen som CMV. För detta steg är det viktigt att använda responder PBMC från givare med tidigare visat proliferativa svar på CMV lysat.</li><li> Label tre 96 brunnar "Sekundär MLR CMV" Dag 3, 5 och 7.</li><li> För att förbereda responder celler för sekundära MLR att mäta CMV svar, överföring 5 ml från varje bulk kontroll och alloanergizing co-kulturer till 15 ml rör och tvätta, räkna och resuspendera till 1 miljon celler / ml i CM som tidigare beskrivits . Pipettera 100 ml cellsuspension från varje Falcon röret i ett 3 brunnar på varje platta.</li><li> Lägg till 0,1 ml av CMV lysat i 100ul CM i brunnarna</li><li> Lägg till 200 ml CM 6 brunnar på alla plattor som negativ kontroll och tillsätt 200 ml PBS för att tömma brunnar. Placera plattorna i inkubatorn.</li></ol><p class="jove_title"> 7. Mätning spridning i primära och sekundära MLRs</p><ol><li> Responder celltillväxt mäts genom thymidinupptag analysen i den primära och sekundära MLRs. Spridning mäts vid Dag 4, 5 och 6 efter den primära MLR plattorna sätts upp och vid Dag 3, 5 och 7 efter Sekundära MLR plattorna sätts upp.</li><li> 1mCi av tritiated tymidin tillsätts brunnar 16 timmar före skörd</li><li> Efter tillsats av tritiated tymidin är plattan inkuberas i further16 timmar sedan skördas på en filtermatta med en Tomtec skördare (eller liknande). Lufttorka filtermat under en timme sedan plats i ett prov påse, tillsätt 5 ml vätska scintillation och tätning. Läs plattan i ett Wallac Micro beta scintillationsräknare eller liknande.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Beräkning av effekten hos samtidigt stimulerande blockad i Primär MLR</p><ol><li> Den procentuella hämningen (PI) av primär alloresponses beräknas som 100 x [betyder cpm i allostimulation brunnar (bulk alloanergy co-kultur PBMC) – betyder cpm i allostimulation brunnar (bulk kontrollera co-kultur PBMC)}<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" ></ol><p class="jove_title"> 9. Beräkna Effekten av Alloanergization i den sekundära MLR</p><p class="jove_content"> PI av sekundära alloresponses beräknas som<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" ><p class="jove_title"> 10. Beräkning av specificitet Alloanergization i den sekundära MLR</p><ol><li> Efter stimulering av celler med CD3 och CD28 kan TP allostimulators eller CMV-antigen, PI av svar på dessa stimuli även beräknas med följande formel. Detta ger ett mått på specificitet alloanergization processen</li></ol><p class="jove_title"> 11. Generera Alloanergized Donor PBMC för klinisk användning efter allogen Hematologisk stamcellstransplantation (HSCT)</p><ol><li> Alloanergized donator PBMC kan genereras för klinisk användning efter HLA-inkompatibla allogen HSCT använder protokollet som beskrivs ovan</li><li> När genererar celler för klinisk användning, är responder PBMC erhålls från HSCT givare och stimulatorn PBMC från HSCT mottagaren före transplantationen.</li><li> När genererar PBMC för kliniskt bruk, är alla steg utförs under goda förhållanden tillverkningsprocessen ackrediterade bearbetning stamceller anläggningar.</li><li> Ytterligare kvalitetskontroll analyser utförs även endotoxin analyser och Gramfärgning och kultur för att uppfylla säkerhetskraven kriterier före övergången av celler för klinisk användning</li></ol><p class="jove_title"> 12. Representativa resultat</p><p class="jove_content"> Använda HLA-inkompatibla stimulatorn och responder PBMC, förekomsten av co-stimulerande blockad i den primära MLR minskar betyder alloproliferation som responders PBMC vid dag 5 till cirka 30% (+ / – 10%, innebär + / – standardavvikelse) som ses hos kontrollera primära MLR i avsaknad av co-stimulerande blockad. Detta motsvarar en genomsnittlig hämning av primära alloproliferation på ca 70% (+ / – 10%) vid D5,<strong> Figur 1 A och B</strong>.</p><p class="jove_content"> I den sekundära MLR på Dag 5, är FP alloproliferation av alloanergized PBMC vanligen 10-15% (+ / – 10%) som ses med styrning PBMC motsvarar en genomsnittlig hämning av spridning av 85-90% (+ / – 10 %),<strong> Figur 2A och B</strong>. Detta visar att alloanergized PBMC är hyporesponsiva till FP allostimulators.</p><p class="jove_content"> I motsats alloanergized PBMC normalt behålla 70-100% av deras spridning till mitogener (CD3/CD28 antikroppar), TP allostimulators och CMV lysat (i CMV-reaktiva givare). Detta visar att hyporesponsiv av alloanergized PBMC är specifikt för FP alloantigens.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Figur 1. A.</strong> Spridningsavtalet (avgörs av thymidinupptag) i en Primär Blandad Lymphocyte Reaktion med HLA-inkompatibla stimulatorn och responder perifera mononukleära blodceller (PBMC) i frånvaro eller förekomst av co-stimulerande blockad använda humaniserad monoklonal anti-B7.1 och B7.2 antikroppar. Resultaten redovisas som medelvärde (+ /-sd) för 8 representativa experiment med unika stimulator-responder par.<strong> B</strong>. Andel hämning av alloproliferation i primär MLRs utförs i närvaro av co-stimulerande blockad använda humaniserad monoklonal anti-B7.1 och B7.2 antikroppar. Resultaten redovisas som medelvärde (+ /-sd) för samma 8 unika stimulator-responder par visas i Figur 1A.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figur 2. A.</strong> Spridningsavtalet (avgörs av thymidinupptag) i sekundära MLRs där responder PBMC från primär MLRs utförs i frånvaro (kontroll PBMC) eller förekomst av co-stimulerande blockad (alloanergized PBMC) är restimulated med bestrålade första parten stimulatorer. Resultaten redovisas som medelvärde (+ /-sd) för 8 unika stimulatorn-responder par visas i Figur 1.<strong> B</strong>. Andel hämning av First Party alloproliferation i sekundära MLRs där responder PBMC från primär MLRs utförs i frånvaro (kontroll PBMC) eller förekomst av co-stimulerande blockad (alloanergized PBMC) är restimulated med bestrålade första parten stimulatorer. Resultaten redovisas som medelvärde (+ /-sd) för 8 unika stimulatorn-responder par visas i Figur 1 och Figur 2A.</p>

Discussion

<p class="jove_content"> Induktion av alloantigen-specifika hyporesponsiv eller anergi i givaren PBMC via allostimulation i närvaro av co-stimulerande blockaden är en enkel teknik för produktion av givare PBMC med nedsatt alloreactivity. Vi har utvecklat processen i laboratoriet och är för närvarande tillämpar strategin på kliniken för att generera donator PBMC med nedsatt alloreactivity för infusion efter HLA-inkompatibla allogena HSCT. Syftet med att använda en sådan terapi är att förbättra immunförsvaret beredning utan självrisk toxicitet. Även vår nuvarande klinisk tillämpning av strategin är begränsad till fastställandet av allogena HSCT kunde tillvägagångssätt kunna tillämpas på andra miljöer där vävnadsskada orsakas av oönskade T-cell reaktioner, såsom avstötning av fasta organtransplantation eller autoimmun sjukdom.</p><p class="jove_content"> Flera reagenser kan användas för blockaden av CD28-medierad co-stimulerande signaler under alloanergization co-kultur process. Här beskriver vi vår nuvarande protokollet med klinisk kvalitet humaniserade murina monoklonala antikroppar riktade mot de ligander av CD28 (B7.1 och B7.2). Icke-kliniska klass murint anti-humant B7.1 och B7.2 antikroppar är kommersiellt tillgängliga från flera tillverkare. Alternativt kan fusionsproteinet Cytotoxiska T-lymfocyter antigen (CTLA) 4-immunglobulin (IG) användas för att blockera CD28-costimulation under alloanergization processen. CTLA4-IG, som består av den extracellulära delen av CTLA4 molekyl kopplad till IgG Fc gamma receptor, binder med hög affinitet till B7.1 och B7.2. Användningen av CTLA4-IG ger liknande effekt och specificitet alloanergization mänskliga PBMC.</p><p class="jove_content"> Tekniken att alloanergization är enkel att utföra. Färska eller tidigare frysförvarade stimulatorn PBMC kan användas utan några betydande variationer i resultatet av processen. Kravet på en enda relativt kort ex vivo inkuberingssteget utan cellsortering rutiner minimerar risken för celldöd och bakteriell kontamination av celler före infusion, vilket gör att strategin relativt enkel att tillämpa vid en klinisk skala.</p><p class="jove_content"> En begränsning av den metod vi beskriver (och andra metoder att selektivt minska alloreactivity av mänskliga celler) är avsaknaden av en realtids-analys för att avgöra kvarvarande alloreactivity. Spridning analyser tar 3-5 dagar att utföra för att bekräfta att minska alloreactivity och celler skapas för klinisk användning måste infunderas innan resultaten av dessa tester är tillgängliga. Dessutom mätning av spridning av PBMC av thymidinupptag, även lätt att utföra, åtgärder spridning av B-celler och andra delmängder celler förutom T-cellernas tillväxt. CFSE färga utspädning av responder PBMC kan användas som en alternativ analys och medger bestämning av T-cell delmängd-specifika alloproliferation. Ett sätt att förbättra den kliniska tillämpningen av vår strategi tillvägagångssätt skulle vara att utveckla och validera en analys av alloreactivity som tar bara några timmar att utföra som kan göras innan utsättning av alloanergized celler för klinisk användning.</p><p class="jove_content"> Förutom att visa på efficiacy av strategin är det också viktigt att bekräfta processen specificiteten alloanergization. Detta kan enkelt göras genom bestämning av relativa bevarandet av alloresponses specifika för tredje part allostimulators och när CMV-reaktiva donator celler som alloanergized, genom bevarande av proliferativa svar på CMV</p>

Materials

Name of Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Human AB serum (heat inactivated)	Gemini Bio-Products	100-512	Use validated batches
Complete Culture Media (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin
Irradiator	GammaCell 1000
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps	Corning, Inc.	3056
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies			See protocol text
U bottomed 96 well culture plates	BD Labware	353077
Monoclonal CD3 antibody	Beckman Coulter	IM0178	Reconstitute with 200ml distilled water
Monoclonal CD28 antibody	Beckman Coulter	IM1376	Reconstitute with 200ml distilled water
CMV grade 2 antigen	Microbix	EL-01-02
Tritiated Thymidine	NEN	NET027
Scintillation Fluid	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Printed Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Filter Bag	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter	Wallac