Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

Sommario

La giunzione neuromuscolare (NMJ) di Drosophila melanogaster È un sistema importante modello per lo studio normale funzione sinaptica e perturbazioni a funzione sinaptica si trovano in alcune malattie neurologiche. Vi presentiamo un protocollo per la dissezione del Drosophila Larvale motore del sistema e immunocolorazione per le proteine ​​all'interno della zona attiva NMJ.

Abstract

Le larve di Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) è un modello eccellente per lo studio della struttura e della funzione sinaptica. Drosophila è ben noto per la facilità di potenti manipolazioni genetiche e il sistema nervoso larvale è dimostrata particolarmente utile per studiare non solo la normale funzione ma anche perturbazioni che accompagnano una malattia neurologica (Lloyd e Taylor, 2010). Molte molecole chiave sinaptica si trovano in Drosophila sono presenti anche nei mammiferi e come la maggior parte delle sinapsi eccitatorie sistema nervoso centrale nei mammiferi, la NMJ Drosophila è glutammatergica e dimostra attività-dipendente rimodellamento (Koh et al., 2000). Inoltre, i neuroni Drosophila possano essere identificati individualmente, perché i loro modelli di innervazione sono stereotipati e ripetitivi che consente di studio ha identificato i terminali sinaptici, come quelle tra i neuroni motori e il corpo-muro fibre muscolari che innervano (Keshishian e Kim, 2004). L'esistenza di componenti sinapsi evolutivamente conservata insieme alla facilità di manipolazione genetica e fisica del modello Drosophila ideale per lo studio dei meccanismi alla base della funzione sinaptica (Budnik, 1996).

Le zone attive ai terminali sinaptici sono di particolare interesse perché questi sono i luoghi di rilascio dei neurotrasmettitori. NC82 è un anticorpo monoclonale che riconosce la proteina Bruchpilot Drosophila (BRP), un membro della famiglia CAST1/ERC che è una componente importante della zona attiva (Wagh et al., 2006). BRP ha dimostrato di forma direttamente la zona attiva T-bar ed è responsabile in modo efficace il clustering Ca ^{2 +} canali sotto la T-bar densità (Fouquet et al., 2009). Mutanti di BRP hanno ridotto Ca ^{2 +} densità di canali, depresso rilascio delle vescicole evocato, e modificato a breve termine plasticità (Kittel et al., 2006). Alterazioni zone attive sono state osservate in modelli di malattia Drosophila. Per esempio, immunofluorescenza utilizzando l'anticorpo NC82 ha mostrato che la densità zona attiva è stata ridotta in modelli di sclerosi laterale amiotrofica e la sindrome di Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009.). Quindi, la valutazione delle zone attive, o altre proteine ​​sinaptiche, in modelli larve di Drosophila malattia può fornire un indizio prezioso iniziale per la presenza di un difetto sinaptica.

Preparare tutto il montaggio larve sezionato Drosophila per l'analisi di immunofluorescenza del NMJ richiede una certa abilità, ma può essere realizzato dalla maggior parte degli scienziati con un po 'di pratica. Presentato è un metodo che prevede le larve più per essere sezionati e immunostained nel piatto dissezione stessa, limitando le differenze ambientali tra ciascun genotipo e fornendo animali sufficiente per la fiducia nella riproducibilità e analisi statistiche.

Protocollo

1. Preparazione per Immunofluorescenza:

1. Per creare una superficie dissezione, versare Sylgard 184 Base elastomeri di silicone in un piatto piccolo coltura di tessuti. Fare attenzione a non riempire completamente la piastra in modo che l'area dissezione è più basso del cerchio.
2. Trim pin dissezione, per una lunghezza di circa 3,5 mm per una maggiore facilità di manipolazione, e assicuratevi di avere almeno 6 pin per ogni larva.
3. Avrete bisogno di forcipe smussato che permetterà di cogliere che i perni per la dissezione.

2. Dissezione delle larve:

1. Seleziona vagare terzo larve instar che sono str....

Discussione

Per i neuroni, la zona terminale sinaptico è di fondamentale importanza, ed è il ponte per una corretta comunicazione tra il post-e pre-sinaptici delle cellule. Un modo efficace per studiare la salute del neurone in modelli di malattia è quello di analizzare le proteine ​​del terminale sinaptico mediante immunofluorescenza. Il metodo di immunofluorescenza qui presentata consente al ricercatore di esaminare le larve di molti contemporaneamente, limitando le differenze ambientali tra i gruppi. Il sistema nervoso centrale .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sylgard 184 Base in silicone elastomero	Dow Corning	68037-59-2	Dopo la miscelazione permettono di bolle a salire lentamente mettendo su dei rotatori lenti o che consentono di sedersi per 30 minuti o più.
Acciaio Minutien Pins	Strumenti Scienza multa	26002-10	Tagliare a ca. 3-4mm di lunghezza con le forbici normali
Pinze laminectomia (Blunt-Usato per afferrare pin)	Strumenti di Scienze multa	11223-20	Usa come pinze per afferrare smussato perni
Pinza dissezione	Mondo Strumenti di precisione	501985
Vännäs SuperFine Forbici, 8cm lunghi	Mondo Strumenti di precisione	501778
Topo anti-Brp anticorpi	DSHB	NC82	Usa diluizione 1:50
Cy3 Affinipure capra anti-perossidasi di rafano	Jackson ImmunoResearch	123-165-021	Uso a 1:200 diluizione
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG	Invitrogen	A11001	Usa ca. Diluizione 1:200