Een β-glucuronidase (GUS) Op basis Dood van de Cel Assay
Summary
Geprogrammeerde celdood assays gebruikt in zoogdieren systemen zoals DNA laddering of TUNEL testen, zijn vaak moeilijk te reproduceren in planten. In combinatie met een GUS verslaggever systeem, stellen wij voor een snelle, plant op basis van voorbijgaande test om de mogelijke dood eigenschappen van specifieke genen te analyseren.
Abstract
We hebben een nieuwe tijdelijke plant expressie systeem dat tegelijkertijd drukt de reporter-gen, β-glucuronidase (GUS), met een vermeende positieve of negatieve regulatoren van celdood. In dit systeem, N. benthamiana bladeren zijn co-geïnfiltreerd met een 35S gedreven expressiecassette met het gen te analyseren, en het GUS vector pCAMBIA 2301 met behulp van Agrobacterium-stam LBA4404 als een voertuig. Omdat de levende cellen nodig zijn voor GUS expressie te komen, is het verlies van GUS-activiteit te verwachten wanneer deze marker-gen is co-uiting met positieve regulatoren van celdood. Even, verhoogde GUS activiteit wordt waargenomen wanneer anti-apoptotische genen worden gebruikt in vergelijking met de vector te controleren. Zoals hieronder wordt weergegeven, hebben we met succes gebruikt dit systeem in ons lab om zowel pro-en anti-dood-spelers te analyseren. Deze omvatten de plant anti-apoptotische Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) familie, maar ook, bekende zoogdieren induceren van celdood, zoals BAX. Daarnaast hebben we gebruikt dit systeem om de dood functie van specifieke afknottingen in eiwitten, die aanwijzingen kunnen geven over de mogelijke post-translationele modificatie / activering van deze eiwitten te analyseren. Hier presenteren wij een snelle en gevoelige planten gebaseerde methode, als een eerste stap in het onderzoek naar de dood functie van specifieke genen.
Protocol
Discussion
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
Riferimenti
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
- Hodal, L. . Plant Science. 87, 115-115 (1992).
- Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
- Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
- Yan, J. . Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
- Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
- Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
- Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
- Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).
