β - glucuronidase (거스)을 기반으로 세포를 파괴 분석
Summary
일반적으로 이러한 DNA를 laddering 또는 TUNEL의 assays 같은 포유류의 시스템에서 사용되는 프로그램 세포 사망 assays은 종종 공장에서 재현하기가 어렵습니다. 귀스 기자 제도와 함께, 우리는 특정 유전자의 잠재적인 사형 속성을 분석하는 빠른, 식물 기반의 과도 분석을 제안합니다.
Abstract
우리는 동시에 세포 죽음의 putative 긍정적이거나 부정적인 규제와 리포터 유전자, β – glucuronidase (거스)를 표현하는 소설 과도 공장 표현 시스템을 개발했습니다. 이 시스템에서는, N. benthamiana의 잎은 분석하는 유전자를 포함하는 35S 구동 표현 카세트 공동 침투되며, 거스 벡터 pCAMBIA 2301은 차량으로 Agrobacterium 스트레인 LBA4404를 사용합니다. 거스 표현식이 발생하는 라이브 세포가 필요하기 때문에이 마커 유전자가 세포 죽음의 긍정적인 규제와 함께 공동으로 표현 때 거스 활동의 손실이 예상된다. 마찬가지로, 거스 활동 안티 apoptotic 유전자는 벡터 제어에 비해 사용하는 경우 관찰 증가했다. 아래 그림과 같이, 우리는 성공적으로 모두 프로와 안티 죽음 플레이어를 분석하기 위해 실험실에서이 시스템을 사용하고 있습니다. 이들은 같은 백스와 같은 세포 사망의 포유 동물 inducers 알려진 안티 – apoptotic 공장 BCL – 2 관련 athanoGene (BAG) 가족뿐만 아니라를 포함. 또한, 우리는이 단백질의 가능한 포스트 translational 수정 / 정품 인증에 대한 단서를 제공할 수 단백질 내의 특정 truncations의 죽음 기능을 분석하기 위해이 시스템을 사용하고 있습니다. 여기, 우리는 특정 유전자의 죽음 기능을 조사하는 초기 단계로, 신속하고 민감한 식물을 기반으로 방법을 제시한다.
Protocol
Nicotiana benthamiana 공장은 25 ° C에서 온도 제어 성장 챔버 재배하고 있습니다. 3~6주 오래된 식물의 완전 확장 건강한 단풍이 사용됩니다. 팁 : 더 나은 결과를 새로 신흥 잎을 사용하여 얻을 수 있습니다 1. Agrobacterium 과도 침투 프로토콜 : 1 일 세포 죽음에 대한 assayed하는 유전자 (들)과 포함하는 벡터로 적절한 벡터를 포?…
Discussion
<p class="jove_content"> 그것은 포유류의 시스템에서 일반적인 식물의 세포 사망 탐지 기술을 사용하는 것이 어렵습니다. 귀스 기자 제도와 함께, 우리는 세포 죽음 선수의 검출 및 분석을위한 식물을 기반으로, 중요한 방법을 제시한다. 이 방법은 라이브 세포가 발생하는 거스 표현에 필요한 그 단순한 사실을 활용합니다. 의미있는 결과와 repeatability를 보장하기 위해, 그것은 거스 카세트 및 assayed되도록 유전자를 숨?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
Riferimenti
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
- Hodal, L. . Plant Science. 87, 115-115 (1992).
- Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
- Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
- Yan, J. . Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
- Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
- Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
- Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
- Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).
Tags
A β-glucuronidase (GUS)Transient Plant Expression SystemReporter GenePositive Regulators Of Cell DeathN. Benthamiana LeavesCo-infiltration35S Driven Expression CassetteGene AnalysisGUS Vector PCAMBIA 2301Agrobacterium Strain LBA4404Live CellsMarker GeneAnti-apoptotic GenesPro- And Anti-death PlayersBcl-2 Associated AthanoGene (BAG) FamilyMammalian Inducers Of Cell DeathBAXPost-translational Modification/activation Of ProteinsRapid And Sensitive Plant Based Method
Citazione di questo articolo
Kabbage, M., Ek-Ramos, M., Dickman, M. A β-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay. J. Vis. Exp. (51), e2680, doi:10.3791/2680 (2011).