A β-glucuronidase (GUS) Ensaio Baseado Morte celular
Summary
Ensaios de morte celular programada comumente usado em sistemas de mamíferos, tais como DNA laddering ou ensaios de TUNEL, muitas vezes são difíceis de reproduzir em plantas. Em combinação com um sistema de repórter GUS, propomos uma rápida, planta ensaio baseado transitória para analisar as propriedades morte potencial de genes específicos.
Abstract
Nós desenvolvemos um sistema de expressão transiente romance planta que ao mesmo tempo expressa o gene repórter, β-glucuronidase (GUS), com supostos reguladores positivos ou negativos de morte celular. Neste sistema, N. deixa benthamiana são co-infiltradas com uma cassete de expressão 35S impulsionado contendo o gene a ser analisado, eo GUS vector pCAMBIA 2301 usando Agrobacterium LBA4404 tensão como um veículo. Porque as células vivas são necessários para a expressão GUS a ocorrer, a perda da atividade GUS é esperada quando este gene marcador é co-expressa com os reguladores positivos da morte celular. Igualmente, o aumento da atividade GUS é observada quando anti-apoptóticos genes são usados em comparação com o controle de vetores. Como mostrado abaixo, temos utilizado com sucesso este sistema em nosso laboratório para analisar os dois jogadores pró e anti-morte. Estes incluem a planta anti-apoptótico Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) da família, bem como, conhecidos indutores de morte celular de mamíferos, como BAX. Além disso, temos utilizado este sistema para analisar a função da morte de truncamentos específicos dentro de proteínas, o que poderia fornecer pistas sobre a modificação pós-translacional possível / ativação destas proteínas. Aqui, apresentamos um método rápido e sensível de plantas com base, como um passo inicial na investigação da morte de função de genes específicos.
Protocol
Discussion
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Rifampicin | VWR | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone (MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
Riferimenti
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