A β-glucuronidasa (GUS), basada en células de ensayo Muerte

Summary

Ensayos muerte celular programada de uso común en los sistemas de mamíferos, tales como escalamiento de ADN o los ensayos de TUNEL, a menudo son difíciles de reproducir en las plantas. En combinación con un sistema reportero GUS, se propone una vía rápida, a base de plantas de ensayo transitorio para analizar las propiedades de la muerte potencial de genes específicos.

Abstract

Hemos desarrollado un novedoso sistema de expresión transitoria de plantas que al mismo tiempo expresa el gen reportero β-glucuronidasa (GUS), con la supuesta reguladores positivos o negativos de la muerte celular. En este sistema, N. benthamiana hojas son co-infiltrado con un casete de expresión 35S impulsado que contiene el gen para ser analizados, y el vector GUS pCambia 2301 utilizando LBA4404 cepa de Agrobacterium como un vehículo. Dado que las células vivas son necesarios para la expresión de GUS que se produzca, la pérdida de la actividad GUS se espera que cuando este gen marcador es co-expresada con reguladores positivos de la muerte celular. Igualmente, el aumento de la actividad GUS se observa cuando los genes anti-apoptóticos se utilizan en comparación con el control de vectores. Como se muestra a continuación, hemos utilizado con éxito este sistema en nuestro laboratorio para analizar los dos jugadores a favor y en contra la muerte. Estos incluyen la planta de anti-apoptótica Bcl-2 asociada athanoGene (BAG) de la familia, así como, los mamíferos conocidos inductores de la muerte celular, tales como BAX. Además, hemos utilizado este sistema para analizar la función de la muerte de truncamientos específicos dentro de las proteínas, lo cual podría proporcionar pistas sobre la posible modificación post-traduccional / activación de estas proteínas. A continuación, presentamos un método rápido y sensible de plantas basado, como un paso inicial en la investigación de la función de la muerte de genes específicos.

Protocol

Plantas de Nicotiana benthamiana se cultivan en una cámara de crecimiento con temperatura controlada a 25 ° C. Totalmente expandido hojas sanas de plantas de 3-6 semanas de edad se utilizan. Consejo: Se obtienen mejores resultados mediante el uso de hojas de reciente aparición 1. Agrobacterium protocolo de infiltración transitoria: Día 1 LB racha / rifampicina (25 mg / ml) / kanamicina (100 mg / ml) placas de aga…

Discussion

<p class="jove_content"> A menudo es difícil de usar las técnicas de detección de células de muerte en las plantas que son comunes en sistemas de mamíferos. En combinación con un sistema reportero GUS, se presenta un método a base de plantas, sensibles para la detección y análisis de los jugadores de la muerte celular. Este método aprovecha el simple hecho de que las células vivas son necesarios para la expresión de GUS a ocurrir. Para asegurar resultados significativos y repetibilidad, es fundamental que las culturas que alberga…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Rifampicin	VWR	IC19549001	25mg/mL stock in DMSO
4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone)	VWR	TCD2666	0.981 g/mL in DMSO (1M stock)
2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES)	VWR	EM-6110	1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media
Bacto-tryptone	Fisher	BP1421-2	10g/L in water for making 1 L of LB medium
Bacto-yeast extract	VWR	EM1.03753.0500	5g/L in water for making 1 L of LB medium
Sodium chloride	VWR	EM-7710	10g/L in water for making 1 L of LB medium
Sodium phosphate monobasic monohydrate	VWR	MK-7868-12	2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	VWR	EMD-SX0715-1	5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	EM-MX0070-1	2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media
N-Lauroylsarcosine	VWR	TCL0151-500G	0.1% v/v in GUS buffer
5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc)	Gold Biotechnology	G1281C	1mg/100uL in methanol 100%
4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG)	Sigma	M5664	2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer
Potassium ferrocyanide trihydrate	VWR	EM-PX1460-1	100mM stock for X-gluc substrate solution
β-Methylumbelliferone (MU)	Sigma-Aldrich	M1381	For MU standard curve use GUS extraction buffer
Sodium carbonate	VWR	EM-SX0395-11	0.2 M in water for making GUS stop buffer