Ett β-glukuronidas (GUS) Baserat Celldöd analys

Summary

Programmerad celldöd analyser som vanligen används i däggdjur system såsom DNA laddering eller analyser Tunel, är ofta svåra att återge i växter. I kombination med en GUS reporter system, föreslår vi en snabb, växtbaserade övergående analys för att analysera potentiella död egenskaper specifika gener.

Abstract

Vi har utvecklat ett nytt tillfälligt system som växt uttryck som samtidigt uttrycker reporter genen, β-glukuronidas (GUS), med förmodad positiv eller negativ regulatorer av celldöd. I detta system, N. benthamiana bladen är co-infiltrerade med en 35S driven uttryck kassett som innehåller genen som ska analyseras, och GUS vektor pCAMBIA 2301 med hjälp av Agrobacterium stam LBA4404 som ett fordon. Eftersom levande celler krävs för GUS uttryck att inträffa, är förlust av GUS aktiviteten förväntas när detta markörgen är co-uttrycks med positiva regulatorer av celldöd. Likaså ökade GUS aktivitet observeras när anti-apoptotiska gener används jämfört med vektorstyrning. Som framgår nedan har vi använt med framgång detta system i vårt labb för analys av både pro-och anti-döden-spelare. Dessa inkluderar anläggningen anti-apoptotiska Bcl-2 associerad athanoGene (BAG) familj, liksom, känd däggdjursceller inducerar celldöd, såsom BAX. Dessutom har vi använt detta system för att analysera död funktionen av specifika truncations inom proteiner, som skulle kunna ge ledtrådar om eventuella post-translationell modifiering / aktivering av dessa proteiner. Här presenterar vi en snabb och känslig växt baserad metod, som ett första steg i utredningen av dödsfallet funktionen av specifika gener.

Protocol

Nicotiana benthamiana växter som odlas i en temperatur-kontrollerad tillväxt kammare vid 25 ° C. Fullt utbyggt friska blad på 3-6 veckor gamla anläggningar används. Tips: Bättre resultat erhållits med hjälp av framväxande bladen 1. Agrobacterium övergående infiltration protokoll: Dag 1 Streak LB / Rifampicin (25 mikrogram / ml) / Kanamycin (100 mikrogram / ml) agarplattor med glycerol bestånd av Agrobacte…

Discussion

<p class="jove_content"> Det är ofta svårt att använda celler tekniker död upptäckt i växter som är vanliga i däggdjur system. I kombination med en GUS reporter system, presenterar vi en anläggning baserad, känslig metod för detektion och analys av celldöd spelare. Denna metod utnyttjar det enkla faktum att levande celler krävs för GUS uttryck att inträffa. För att säkerställa meningsfulla resultat och repeterbarhet är det viktigt att kulturerna hysa den GUS kassett och genen som ska analyseras är infiltrerade på lika ny…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Rifampicin	VWR	IC19549001	25mg/mL stock in DMSO
4′-hydroxy-3′,5′-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone)	VWR	TCD2666	0.981 g/mL in DMSO (1M stock)
2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES)	VWR	EM-6110	1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media
Bacto-tryptone	Fisher	BP1421-2	10g/L in water for making 1 L of LB medium
Bacto-yeast extract	VWR	EM1.03753.0500	5g/L in water for making 1 L of LB medium
Sodium chloride	VWR	EM-7710	10g/L in water for making 1 L of LB medium
Sodium phosphate monobasic monohydrate	VWR	MK-7868-12	2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	VWR	EMD-SX0715-1	5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	EM-MX0070-1	2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media
N-Lauroylsarcosine	VWR	TCL0151-500G	0.1% v/v in GUS buffer
5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc)	Gold Biotechnology	G1281C	1mg/100uL in methanol 100%
4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG)	Sigma	M5664	2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer
Potassium ferrocyanide trihydrate	VWR	EM-PX1460-1	100mM stock for X-gluc substrate solution
β-Methylumbelliferone (MU)	Sigma-Aldrich	M1381	For MU standard curve use GUS extraction buffer
Sodium carbonate	VWR	EM-SX0395-11	0.2 M in water for making GUS stop buffer