يوصف أسلوب النقر على الكيمياء التي تسمح لوضع العلامات وسريع موسع ، وقوية من آلكاين الموسومة glycans في الأجنة الزرد. وقد التقط glycans Fucosylated في طبقة التغليف الأجنة الزرد في مرحلة تكون المعيدة في وقت متأخر من هذه الدراسة.
Abstract
وقد تم مؤخرا glycans التصوير في فيفو تمكين باستخدام مراسل الكيميائية bioorthogonal الاستراتيجية عن طريق علاج الخلايا أو الكائنات الحية مع السكريات الأحادية أو أزيد آلكاين الموسومة – 1 ، 2. أدرجت تعديل السكريات الأحادية ، التي تتم معالجتها بواسطة آلات السكروز غليكان ، في glycoconjugates سطح الخلية. وbioorthogonal أزيد أو السماح به آلكاين ثم اقتران التساهمية مع تحقيقات نيون للالتصور ، أو تقارب مع تحقيقات وتحليلات لتخصيب glycoproteomic. يصف هذا البروتوكول الإجراءات التي تستخدم عادة لتصوير موسع من glycans fucosylated في الأجنة الزرد ، ومنها : 1) microinjection أحد خلايا الأجنة المسرح مع الناتج المحلي الإجمالي alkynylfucose – 5 (الناتج المحلي الإجمالي FucAl) ، 2) وضع العلامات glycans fucosylated في طبقة من يغلف الزرد الأجنة ، مترافق مع آزيد fluorophores حيويا عبر النحاس (I) المحفزة آزيد – آلكاين الحلقيه (CuAAC) ، والتصوير 3) بواسطة المجهر مبائر 3. يمكن أن يكون الأسلوب هو موضح هنا مدد بسهولة إلى فئات أخرى من تصور glycans ، glycans مثل التي تحتوي على حمض السياليك 4 و N – acetylgalactosamine 5 ، 6 ، في البلدان النامية والزرد في الكائنات الحية الأخرى.
Protocol
1. جمع البيض وDechorionation جمع ونقل البيض إلى طبق بتري الزرد 35mm ، كما إزالة أكبر قدر ممكن من المياه ثم إضافة 1 E Pronease ملغم / لتر في المتوسط الجنين E3 (5 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 0.17 ملي بوكل ، 0.33 ملي CaCl 2 · 2H 2 O ، 0.33 مل…
Discussion
<p class="jove_content"> الجزيئات الحيوية التصوير<em> في الجسم الحي</em> يقدم أفكارا الحرجة أنشطتها البيولوجي في بيئاتها الأصلية. في هذا الفيديو ، ونظهر كيف يتحقق توسيم glycans fucosylated في طبقة التغليف الأجنة الزرد التي microinjecting الأجنة مرحلة واحدة مع خلية الناتج المحلي الإجمالي ، واقتران FucAl fluorophore ثاني خطوة من خلال BTT…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (GM093282 لPW ؛ 3U54AI057158 – 06S1 إلى RDS) وصناديق بدء التشغيل من كلية ألبرت اينشتاين للطب.
Jiang, H., Feng, L., Soriano del Amo, D., Seidel III, R. D., Marlow, F., Wu, P. Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (52), e2686, doi:10.3791/2686 (2011).