Verwendung von fluoreszierenden Immuno-Chemie für den Nachweis von Edwardsiella ictaluri In Kanal Wels ( I. punctatus) Proben
Summary
Hier beschreiben wir ein Verfahren auszuarbeiten, die Kennzeichnung von<em> Edwardsiella ictaluri in situ</em> In histologischen Schnitten von Kanal Wels<em> Ictalurus punctatus</em> Mittels indirekter Immunhistochemie mit monoklonalen Antikörpern ED9 als primäre und fluoreszierenden FITC markierte Antikörper als sekundären. Diese für den Nachweis des Bakteriums mit Fluoreszenz-Mikroskopie erlaubt.
Abstract
Während Edwardsiella ictaluri ist ein wichtiger Erreger der Kanal Wels Ictalurus punctatus und wurde vor fast drei Jahrzehnten 1,2 entdeckt, so weit, zu den besten dieser Autoren "Wissen ist keine Methode entwickelt worden, um für die in situ Visualisierung der damit Bakterien in histologischen Schnitten.
Während bakterielle Lokalisation in vivo in früheren Studien mit Platte zählt 3, radiometrische markierte 4, oder Biolumineszenz-Bakterien 5 ermittelt wurde, haben die meisten dieser Studien nur auf die Brutto-Orgel Ebene durchgeführt worden, mit einer Ausnahme 6. Diese Einschränkung ist besonders besorgniserregend, weil E. ictaluri hat eine komplexe Infektionszyklus 1,7, und es hat eine Vielzahl von Virulenzfaktoren 8,9. Das komplexe Zusammenspiel von E. ictaluri mit seinem Gastgeber ist in vieler Hinsicht ähnlich zu Salmonella typhi 10, die in der gleichen taxonomischen Familie ist.
Hier beschreiben wir eine Technik die es erlaubt die Detektion von Bakterien mittels indirekter Immunhistochemie mit dem monoklonalen Antikörper, der von ED9 Ainsworth et al. 11.
Kurz gesagt, ist ein Blockierserum auf Paraffin eingebetteten histologischen Schnitten angewendet, um unspezifische abwartend zu verhindern. E.: Dann werden die Schnitte mit dem primären Antikörper inkubiert ictaluri spezifischen monoklonalen Antikörper ED9. Überschüssige Antikörper werden entfernt und spülte den FITC-markierten Sekundärantikörper hinzugefügt werden. Nach dem Spülen werden die Schnitte mit einem fluoreszierenden spezifischen Eindeckmedium montiert.
Diese für den Nachweis von E. erlaubt ictaluri in situ in histologischen Schnitten von Kanal Wels Gewebe.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll Details eine Technik, die in situ Visualisierung der Welse Erreger Edwardsiella ictaluri in histologischen Schnitten. Um das Beste aus unserer Kenntnis ist dies die erste derartige Protokoll beschrieben.
Der wichtigste Schritt, in unserer Erfahrung ist das Spülen der Antikörper wie im Schritt 4.4 der vorliegenden Protokoll als unzureichend Waschen kann sich in der falsch-positiven Ergebnis.
Das Hauptproblem bei der Interpretat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die technische Unterstützung von Michelle Banes sowie Dr. Petrie-Hanson, Dr. Aale und Timothy Brown für ihre Unterstützung der Entwicklung und Durchführung der Immunhistochemie zu erkennen. Dieses Projekt wurde von USDA CRIS Projekt # MISV-0801310 und der Mississippi State University College of Veterinary Medicine finanziert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Brain Infusion broth | Becton Dickinson | 237200 |
| MS222 | Argent Labs | |
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 |
| Goat anti-mouse FitC | Southern Biotech | 1010-04 |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P-4504 |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 85040C |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma | P-5379 |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S-5761 |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma | S-9625 |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma | S-9390 |
Riferimenti
- Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. . Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. . Fish Pathology. , (2001).
- Lawrence, M. L. . Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. . Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
