Biomolecular interferometric reflectance इमेजिंग सेंसर (आईआरआईएस) रोजगार जांच

Summary

मात्रात्मक, उच्च throughput, वास्तविक समय, और लेबल मुक्त SiO पर biomolecular पता लगाने (डीएनए, प्रोटीन, आदि)<sub2></sub> सतहों एक सरल तकनीक interferometric जो एलईडी रोशनी पर निर्भर करता है, कम से कम ऑप्टिकल घटकों, और एक कैमरा का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है. Interferometric reflectance इमेजिंग सेंसर (आईआरआईएस) सस्ती है, उपयोग करने के लिए सरल है, और स्वरूपों माइक्रोएरे के लिए उत्तरदायी है.

Abstract

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, environmental/agricultural/biodefense monitoring, nanobiotechnology, and more. For diagnostic applications, monitoring (detecting) the presence, absence, or abnormal expression of targeted proteomic or genomic biomarkers found in patient samples can be used to determine treatment approaches or therapy efficacy. In the research arena, information on molecular affinities and specificities are useful for fully characterizing the systems under investigation.

Many of the current systems employed to determine molecular concentrations or affinities rely on the use of labels. Examples of these systems include immunoassays such as the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), polymerase chain reaction (PCR) techniques, gel electrophoresis assays, and mass spectrometry (MS). Generally, these labels are fluorescent, radiological, or colorimetric in nature and are directly or indirectly attached to the molecular target of interest. Though the use of labels is widely accepted and has some benefits, there are drawbacks which are stimulating the development of new label-free methods for measuring these interactions. These drawbacks include practical facets such as increased assay cost, reagent lifespan and usability, storage and safety concerns, wasted time and effort in labelling, and variability among the different reagents due to the labelling processes or labels themselves. On a scientific research basis, the use of these labels can also introduce difficulties such as concerns with effects on protein functionality/structure due to the presence of the attached labels and the inability to directly measure the interactions in real time.

Presented here is the use of a new label-free optical biosensor that is amenable to microarray studies, termed the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS), for detecting proteins, DNA, antigenic material, whole pathogens (virions) and other biological material. The IRIS system has been demonstrated to have high sensitivity, precision, and reproducibility for different biomolecular interactions [1-3]. Benefits include multiplex imaging capacity, real time and endpoint measurement capabilities, and other high-throughput attributes such as reduced reagent consumption and a reduction in assay times. Additionally, the IRIS platform is simple to use, requires inexpensive equipment, and utilizes silicon-based solid phase assay components making it compatible with many contemporary surface chemistry approaches.

Here, we present the use of the IRIS system from preparation of probe arrays to incubation and measurement of target binding to analysis of the results in an endpoint format. The model system will be the capture of target antibodies which are specific for human serum albumin (HSA) on HSA-spotted substrates.

Protocol

1. सब्सट्रेट तैयार कोट सिलिकॉन SiO स्तरित स्वयं adsorbing copoly (डीएमए NAS-एमएपीएस) के साथ 2 substrates : Copolymer संश्लेषण, रासायनिक संरचना, और कोटिंग की प्रक्रिया में प्रकाशित कर रहे हैं: जी Pirri, एफ Damin, एम. Chiari, ई. Bontempi, ले Depero. डीएनए माइक्रोएरे ग्लास स्लाइड्स के लिए एक polymeric adsorbed कोटिंग की विशेषता. गुदा. केम. 2004, 76, 1352-58. संक्षेप में, विआयनीकृत जल (डि) के 5 एमएल बहुलक के 100 मिलीग्राम जोड़कर बहुलक समाधान तैयार करने और 40% संतृप्त अमोनियम सल्फेट ((एनएच 4) 4 2SO) समाधान के 5 एमएल जोड़ने के लिए 0.92 एम. के अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने एक प्रकार के बरतन पर 30 मिनट के लिए समाधान में और फिर डूब चिप्स डि पानी के साथ अच्छी तरह कुल्ला. आर्गन / एन 2 गैस के साथ अच्छी तरह से सूखी. 80 पर बनाओ चिप्स ° सी 15 मिनट के लिए. स्टोर बहुलक लेपित / एक शुष्क वातावरण (निर्वात desiccator) में चिप्स substrates करने के लिए 3 महीने के लिए जब तक जांच प्रक्रिया खोलना. 2. एंटीबॉडी, एंटीजन, / एस एस dsDNA, शाही सेना, आदि: जांच ऐरे की तैयारी वांछित बफर में उचित एकाग्रता जांच () पतला. यह कदम काफी भिन्नता किया जा सकता है, लेकिन एक विशिष्ट प्रयोग 0.5 मिलीग्राम / एमएल के एक फॉस्फेट (0.1 मिलीग्राम / एमएल -1 की सीमा) एकाग्रता में प्रतिजन या आईजीजी इस्तेमाल पीएच 7.4 ≈ खारा (पीबीएस) buffered. एक 96 में रखें समाधान या 384 अच्छी तरह से थाली (या निशानदेही इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए मानक स्रोत प्लेट) वांछित मुद्रित सरणी के लिए पैरामीटर खोलना सेटअप: सतह और समाधान इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए उपयुक्त खोलना मापदंडों का निर्धारण (ध्यान केन्द्रित बार दृष्टिकोण गति, आदि). ग्रिड, ग्रिड लेआउट, को दोहराने के ग्रिड की संख्या, और वांछित चिप पर खोलना स्थान के अनुसार प्रत्येक शर्त के replicates की संख्या का निर्धारण करते हैं. प्लेस substrates और उपयुक्त स्थानों में स्रोत प्लेट बनाने के लिए यकीन है कि बेकार और आपूर्ति की बोतलें तैयार कर रहे हैं की जाँच करें, और मुद्रण रन शुरू. एक उच्च आर्द्रता पर्यावरण में जगह substrates के बाद खोलना (4-18 घंटे) रातोंरात स्थिरीकरण और क्रियाशीलता छोड़ना की प्रक्रिया को आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं समाप्त हो गया है. धो substrates:: 0.1% (PBST) बीच, Pbs, और अंत में विआयनीकृत जल (डी) के साथ पीबीएस उन्हें तीन मिनट के लिए निम्न समाधानों में तीन अलग – अलग washes के लिए जगह है. प्रयोग के प्रकार पर निर्भर करता है (गीला बनाम सूखी), चिप अच्छी तरह से और आर्गन गैस के साथ शुष्क ऊष्मायन शुरू या एक प्रवाह कक्ष में चिप जगह इकट्ठा. Ethanolamine के 30 मिनट के लिए, जबकि एक प्रकार के बरतन प्लेट पर 7.4 करने के लिए समायोजित पीएच के साथ 50 मिमी समाधान में चिप्स submerging द्वारा copolymer की सतह पर शेष एनएचएस समूहों को निष्क्रिय करें. Hydroxylamine या Tris जैसे एक प्राथमिक amine युक्त यौगिक भी लंबे समय से तैयार समाधान करने के लिए प्रोटीन के साथ उपयोग के लिए सुरक्षित है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. अच्छी तरह से क्रियाशीलता छोड़ना पीबीएस तो डि पानी का उपयोग कर समाधान कुल्ला. वैकल्पिक कदम (सतह रसायन शास्त्र नियोजित किया जा रहा के आधार पर): ब्लॉक BSA, कैसिइन, या 30 मिनट के लिए rehydrated दूध का एक समाधान का उपयोग सतह. वर्तमान में polymeric सतह रसायन शास्त्र है कि हम का उपयोग करें के लिए, हम इस कदम प्रदर्शन नहीं बहुलक रीढ़ की हड्डी के रूप में करने के लिए गैर विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी को रोकने में कार्य करता है. 3. डाटा अधिग्रहण और ऊष्मायन प्रक्रिया: Endpoint स्वरूप वांछित बफर में रुचि के लक्ष्य का एक समाधान बनाओ. यहाँ, यह पीबीएस में विरोधी BSA के उचित एकाग्रता (एक 10 एनजी / पीबीएस में विरोधी BSA के एमएल समाधान के 1-10 एमएल पूर्व) के एक समाधान हो जाएगा. इसके अलावा, नकारात्मक नियंत्रण ऊष्मायन के लिए बफर के एक बराबर राशि (लक्ष्य) के बिना सुनिश्चित करें. सभी एकत्र आंकड़ों बाद सामान्य करने के लिए एक सिलिकॉन दर्पण स्कैन ले लो. आईआरआईएस प्रणाली के साथ तैयार जांच सरणी ऊष्मायन कदम से पहले स्कैन करने के लिए प्रत्येक स्थान पर प्रारंभिक ऑप्टिकल ऊंचाई (मास) का निर्धारण. यह सतह पर बड़े पैमाने में परिवर्तन के समुचित विश्लेषण के लिए अनुमति देगा, ऊष्मायन के बाद बंधन स्तर, अर्थात्. यहाँ, कुछ मापदंडों वर्तमान प्रयोग, ऐसे समय जोखिम के रूप में, देखने के क्षेत्र, ध्यान केंद्रित सफल, आदि के लिए समायोजित किया जाएगा एक प्रकार के बरतन प्लेट पर 1 घंटे के लिए तैयार समाधान में डूब चिप (ओं). ऊष्मायन समय काफी आंदोलन के स्तर पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैं, लक्ष्य की एकाग्रता का पता चला जा रहा है, प्रवाह चैम्बर के परिवहन विशेषताओं (अगर पता लगाने के वास्तविक समय मोड का इस्तेमाल किया जा रहा है), लक्ष्य जांच जोड़ी की समानताएं आदि . ऊष्मायन के बाद, धोने 2.5 चरण में वर्णित प्रक्रिया को दोहराने) उसी जांच आईआरआईएस प्रणाली का उपयोग सरणी स्कैन और पूर्व ऊष्मायन तुलना के लिए के बाद ऊष्मायन छवियों को प्राप्त करने के. जहां एक माध्यमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जा रहा है एक सैंडविच परख स्वरूप में उदाहरण के लिए यदि आवश्यक हो तो अलग ऊष्मायन चरणों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. 4. डेटा विश्लेषण प्रत्येक आईआरआईएस स्कैन (तीव्रता छवियों के अनुक्रम) के लिए एकत्र की छवियों फ़िट, समर्थक प्रयोगशाला विकसित सॉफ्टवेयर का उपयोगजांच ऑप्टिकल मोटाई जानकारी युक्त सरणी के एक छवि घटाने. बाध्यकारी का एक त्वरित गुणात्मक विश्लेषण (पंजीकृत) के बाद और ऊष्मायन पूर्व छवियों subtracting द्वारा किया जा सकता है. बंधन उन स्पॉट जहां जन परिवर्तन मनाया गया तीव्रता में परिवर्तन के रूप में दिखाई देगा. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, प्रत्येक हाजिर और मौके के एक वलय बाहर के भीतर प्रत्येक पिक्सेल के लिए ऑप्टिकल मोटाई जानकारी औसतन और इन दो क्षेत्रों के एक प्रत्यक्ष तुलना करने से पृष्ठभूमि की तुलना में इस स्थान का जन घनत्व निर्धारण करते हैं. 5. प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 1 स्तरित सी SiO 2 आईआरआईएस एक प्रतिनिधि एंटीबॉडी सरणी के साथ देखा सब्सट्रेट के एक उदाहरण के योजनाबद्ध दिखाता है. प्रत्येक एंटीबॉडी पहनावा अलग अलग प्रोटीन लक्ष्यीकरण मिलान के लिए विशिष्टता के साथ को दोहराने के में देखा है. दो अलग अलग पूरे वायरस और वायरल प्रोटीन उदाहरण के लक्ष्य के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी परख पर निर्भर करते हैं और गैर विशिष्ट और / या वायरस विशिष्ट किया जा सकता है. चित्रा 2 मानव सीरम albumin (HSA) के बंधन से पता चलता है देखा HSA और खरगोश आईजीजी स्पॉट (नियंत्रण) की एक सरणी के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी. जैसा कि यहाँ देखा है, फिटिंग और ऑप्टिकल के दृढ़ संकल्प के बाद पूर्व और बाद ऊष्मायन के छवियों के लिए thicknesses, बाध्यकारी सरणी के लिए एक अंतर छवि के लिए गुणात्मक बाध्यकारी आकलन बनाया जा सकता है. मात्रात्मक विश्लेषण से पता चलता है कि 2.05 और 0.13 नैनोमीटर ऑप्टिकल ऊंचाई परिवर्तन HSA और खरगोश आईजीजी स्पॉट के लिए मनाया गया, क्रमशः 500 एनजी / एमएल के एक विरोधी HSA ऊष्मायन एकाग्रता के लिए, मतलब है. चित्रा 3 फर प्रोटीन प्रोटीन एकाग्रता और dsDNA oligomer लंबाई पर बाध्यकारी निर्भरता का एक आईआरआईएस माप से पता चलता है. शीर्ष ग्राफ पूर्ण प्रारंभिक immobilized oligomer जांच हाइट्स और बाद ऊष्मायन फर बंधन के लिए ऑप्टिकल ऊंचाई माप से पता चलता है. फर के बढ़ाने सांद्रता (50, 100, 200 एनएम) में वृद्धि हुई डीएनए जांच के लिए बाध्य हुई. oligomers की लंबाई भी अब अधिक बंधन में जिसके परिणामस्वरूप दृश्यों के साथ फर बाध्यकारी प्रभाव डालता है. यहाँ, त्रुटि सलाखों के मतलब से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. नीचे साजिश गणना फर dsDNA कतरा प्रति बाध्यकारी प्रोटीन डिमर से पता चलता है. डिमर बाध्यकारी काफी 200 एनएम के एक फर प्रोटीन एकाग्रता गैर विशिष्ट बंधन के एक उच्च स्तर का सुझाव पर बढ़ा दिया गया था. चित्रा 1 एक उदाहरण जांच आम तौर पर प्रयोग आईआरआईएस प्रणाली के साथ एक मल्टिप्लेक्स फैशन में विशिष्ट वायरस और वायरल घटकों का पता लगाने में इस्तेमाल किया सरणी के योजनाबद्ध. चित्रा 2. मानव सीरम albumin विशिष्ट एंटीबॉडी के बंधन के लिए पोस्ट ऊष्मायन अंतर देखा HSA छवि 500 एनजी / एमएल के एक एकाग्रता में इस लेबल से मुक्त प्रणाली के साथ एकत्र. biomaterial जन घनत्व प्रत्येक स्थान के लिए एक जगह के भीतर ऑप्टिकल मोटाई जानकारी के औसत और तब पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व करने के स्थान के आसपास एक वलय के औसत के साथ इस तुलना के द्वारा निर्धारित किया जाता है. चित्रा 3 फर देखा एक ज्ञात सर्वसम्मति oligomer लंबाई, oligomer के भीतर आम सहमति अनुक्रम के स्थान, और फर प्रोटीन एकाग्रता के आधार पर अनुक्रम के साथ डबल असहाय oligomers के साथ प्रोटीन बातचीत के लिए डेटा बाइंडिंग का प्लॉट . फर प्रत्येक देखा अनुक्रम (ऊपर) के लिए बाध्य प्रोटीन की पूर्ण राशि के बारे में सूचना फर dimers oligomer (नीचे) के प्रत्येक प्रकार के लिए बाध्य की संख्या का अनुमान किया जा सकता है.

Discussion

आईआरआईएस मंच माइक्रोएरे प्रारूप में उच्च throughput डेटा बाइंडिंग इकट्ठा करने के लिए उपयोग करने के लिए एक सरल और तेजी से प्रणाली है. Covalently एक सतह पर विभिन्न कार्यात्मक प्रोटीन या डीएनए जांच immobilizing लक्ष्य / प्रतिजनों / बायोमार्कर आदि. समाधान से कब्जा किया जा सकता है, के रूप में एक immunoassay में. एक या आईआरआईएस प्रणाली के साथ वास्तविक समय प्रारूप endpoint में जांच की स्थिति के पार इन मुलाकातों के मापन के अत्यधिक संवेदनशील और मात्रात्मक जानकारी के लिए प्रत्येक बातचीत के लिए एकत्र किया जा अनुमति देता है. प्रतिनिधि प्रयोग यहाँ विस्तृत बातचीत है कि इस तकनीक के साथ अध्ययन किया जा सकता है के प्रकार के सिर्फ एक उदाहरण है. प्रतिलेखन कारकों वायरल प्रतिजनों, और पूरे वायरस की जांच पहले से प्रदर्शित किया गया है और विश्लेषण कि आईआरआईएस आसानी से संभाल कर सकते हैं के प्रकार के कुछ उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है.

Materials

1. Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide, Silicon Valley Microelectronics, custom order
2. Ammonium sulfate powder, Sigma-Aldrich cat. # A5132
3. Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate, Fisher Scientific cat. # BP665-1
4. Antibody to human serum albumin (Anti-HSA), Sigma-Aldrich cat. # A0433
5. Human serum albumin (HSA), Sigma-Aldrich cat. # A9511
6. Argon or nitrogen gas (ultra-high purity), Airgas cat. # AR UHP300 or # NI UHP300
7. Petri dishes, 60 mm x 15 mm, Fisher Scientific cat. # 0875713A
8. Scienceware® vacuum desiccator, Sigma-Aldrich cat. # Z119016
9. Microcentrifuge tubes, Fisher Scientific cat. # 05-408-120
10. 96-well plates, low cell binding, Nalgene Nunc International cat. # 145399
11. BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer, Bio-Rad
12. Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379
13. Ethanolamine, Sigma-Aldrich # 398136
14. Hydroxylamine, Thermo Scientific cat. # 26103
15. Multi-purpose rotator, Thermo Scientific (Barnstead International), model # 2314, cat. # 2314Q
16. Retiga 2000R camera, QImaging cat. # 01-RET-2000R-F-M-12
17. AcuLED illumination source, PerkinElmer, custom order
18. Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.), Thorlabs