Een nieuwe methode voor ovariële follikel inkapseling in een 3D-fibrine-alginaat interpenetrerend netwerk wordt beschreven. Dit systeem combineert een structurele ondersteuning met proteolytische degradatie van de ontwikkeling van onvolgroeide follikels steun aan rijpe eicellen te produceren. Deze methode kan worden toegepast op de cultuur cel aggregaten tot cel-cel contacten, zonder beperking van de uitbreiding te behouden.
De ovariële follikel is de functionele eenheid van de eierstok dat seks hormonen afscheidt en ondersteunt de eicel rijping. In vitro follikel technieken bieden een tool om model follikel ontwikkeling om de fundamentele biologie te onderzoeken, en worden verder ontwikkeld als een techniek om de vruchtbaarheid te behouden in de kliniek 1-4. Onze in-vitro-cultuur systeem maakt gebruik van hydrogels in om de inheemse ovariële omgeving na te bootsen door het handhaven van de 3D-folliculaire architectuur, cel-cel interacties en paracriene signalen dat de directe follikelontwikkeling 5. Voorheen werden follikels met succes gekweekt in alginaat, een inert algen-afgeleide polysaccharide die gelering ondergaat met calcium-ionen 6-8. Alginaat hydrogelen gevormd bij een concentratie van 0,25% w / v waren de meest tolerante voor follikel cultuur, en behield de hoogste ontwikkelingscompetentie 9. Alginaat hydrogels zijn niet afbreekbaar zijn, dus een toename van het follikel diameter resulteert in een drukkracht op de follikel dat de follikelgroei 10 van invloed kan zijn. We vervolgens ontwikkelden een cultuur gebaseerd op een fibrine-alginaat interpenetrerend netwerk (FA-IPN), waarin een mengsel van fibrine en alginaat tegelijkertijd worden gegeleerd. Deze combinatie zorgt voor een dynamische mechanische omgeving, omdat beide componenten bijdragen aan de stijfheid matrix in eerste instantie, maar proteasen afgescheiden door de groeiende follikel degraderen fibrine in de matrix waardoor alleen alginaat om ondersteuning te bieden. Met het IPN, kan de alginaat inhoud moet lager dan 0,25%, wat niet mogelijk is met alginaat alleen 5. Dus, als de follikel groeit, zal het ervaren een verminderde drukkracht ten gevolge van de verminderde gehalte aan vaste stoffen. Hierin beschrijven we een inkapseling methode en een in-vitro-cultuur systeem voor follikels in de eierstokken binnen een FA-IPN. De dynamische mechanische omgeving bootst de natuurlijke ovariële klimaat waarin kleine follikels wonen in een rigide cortex en verhuizen naar een meer tolerante medulla als ze in omvang toenemen 11. De afbreekbare component kan worden bijzonder kritisch voor de klinische vertaling, om de meer dan 10 6-voudige toename in het volume dat de menselijke follikels normaal ondergaan in vivo te ondersteunen.
De gepresenteerde ovariële follikel inkapseling methode in een FA-IPN maakt follikel cultuur in een 3D omgeving in vitro. Een FA-IPN is een dynamische, cel-responsieve matrix waarin de aanvankelijke mechanische eigenschappen worden bepaald door de combinatie van beide fibrine en alginaat. Tijdens de cultuur, de ingekapselde follikel activeert proteases dat slechts een onderdeel van het IPN, de fibrine, wat resulteert in een geleidelijk afnemende gel stijfheid die wordt bijgedragen uitsluitend door de resterend…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door NIH (U54HD41857 en PL1EB008542, een P30 Biomaterials Core binnen de Oncofertility Consortium Roadmap subsidie).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Fetuin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F3385 | ||
FBS | Invitrogen, Gibco | 10082-139 | ||
Aprotinin | Roche | 10236624001 | ||
CaCl2 | Wako | 039-00475 | 40 mM | |
EGF | Sigma | A412 | ||
rFSH | A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases | |||
hCG | Sigma | CG-5 | ||
Hyaluronidase | Sigma | A1603 | ||
ITS | Sigma | I1884-1VL | ||
L-15 | Gibco | 11415 | ||
αMEM+Gluta MAX | Gibco | 32561 | ||
Pen-Strep | Cellgro | 30-002-CI | ||
TBS | Pierce | 28379 | ||
Tisseel Fibrin kit | Baxter | 921030 | ||
Sodium Alginate | FMC BioPolymers | LF200DL | Mw 418kDa |