Une méthode pour l'encapsulation follicule ovarien et de la Culture dans un protéolytiquement dégradable 3 Système dimensionnelle
Summary
Une nouvelle méthode pour l'encapsulation dans un follicule ovarien 3D fibrine alginate réseau interpénétré est décrite. Ce système combine un soutien structurel à la dégradation protéolytique de soutenir le développement des follicules immatures pour produire des ovocytes matures. Cette méthode peut être appliquée à des agrégats de cellules de culture pour maintenir des contacts cellule-cellule, sans limiter l'expansion.
Abstract
Le follicule ovarien est l'unité fonctionnelle de l'ovaire qui sécrète les hormones sexuelles et soutient la maturation ovocytaire. Dans les techniques in vitro des follicules fournir un outil pour le développement des follicules modèle afin d'étudier la biologie de base, et sont encore en cours de développement comme une technique pour préserver la fertilité dans les Clinique 1-4. Notre système de culture in vitro emploie hydrogels afin de mimer l'environnement par le maintien de l'ovaire natif de l'architecture folliculaire 3D, interactions cellule-cellule et de signalisation paracrine que le développement folliculaire directe 5. Auparavant, les follicules ont été cultivés en alginate avec succès, un gaz inerte algues dérivés de polysaccharides qui subit gélification avec les ions calcium 6-8. Alginate hydrogels formés à une concentration de 0,25% p / v ont été les plus permissives pour la culture de follicule, et conservé la plus haute compétence de développement 9. Alginate hydrogels sont pas dégradables, donc une augmentation dans les résultats de diamètre folliculaire dans une force de compression sur le follicule qui peuvent influer sur la croissance folliculaire 10. Nous avons ensuite développé un système de culture basée sur un réseau de fibrine d'alginate interpénétrés (FA-IPN), dans lequel un mélange de fibrine et de l'alginate sont gélifiés simultanément. Cette combinaison offre un environnement dynamique mécanique, car les deux composants contribuent à la rigidité de matrice d'abord, cependant, les protéases sécrétées par le follicule en croissance dégrade la fibrine dans la matrice d'alginate en laissant seulement à fournir un soutien. Avec l'IPN, le contenu d'alginate peut être réduit en dessous de 0,25%, ce qui n'est pas possible avec de l'alginate seuls 5. Ainsi, comme le follicule se développe, il subira une force réduite à la compression due à la teneur réduite en solides. Nous décrivons ici une méthode d'encapsulation et d'un système de culture in vitro des follicules ovariens dans un FA-IPN. L'environnement mécanique dynamique imite l'environnement naturel dans lequel l'ovaire petits follicules résider dans un cortex rigide et passer à un bulbe plus permissif car ils augmentent en taille 11. La composante dégradable peut être particulièrement critique pour la traduction clinique, afin de soutenir les plus de 10 6 fois plus en volume que les follicules humains subissent normalement in vivo.
Protocol
Discussion
La méthode présentée ovaire follicule encapsulation dans un FA-IPN permet la culture des follicules dans un environnement 3D in vitro. Un FA-IPN est une entreprise dynamique, réactive les cellules de matrice dans laquelle les propriétés mécaniques initiales sont déterminées par la combinaison des deux fibrine et d'alginate. Pendant la culture, le follicule encapsulé active protéases qui dégradent une seule composante de l'IPN, la fibrine, qui se traduit par une rigidité de gel diminue gradu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le NIH (U54HD41857 et PL1EB008542, un Core P30 biomatériaux dans le Oncofertility Consortium feuille de route de subvention).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fetuin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F3385 | ||
| FBS | Invitrogen, Gibco | 10082-139 | ||
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | ||
| CaCl2 | Wako | 039-00475 | 40 mM | |
| EGF | Sigma | A412 | ||
| rFSH | A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases | |||
| hCG | Sigma | CG-5 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | A1603 | ||
| ITS | Sigma | I1884-1VL | ||
| L-15 | Gibco | 11415 | ||
| αMEM+Gluta MAX | Gibco | 32561 | ||
| Pen-Strep | Cellgro | 30-002-CI | ||
| TBS | Pierce | 28379 | ||
| Tisseel Fibrin kit | Baxter | 921030 | ||
| Sodium Alginate | FMC BioPolymers | LF200DL | Mw 418kDa |
Riferimenti
- Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system. Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).
- Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture. Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).
- Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles. Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).
- Smitz, J. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development. Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose. Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).
- Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).
- Xu, M. Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles. Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).
- West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Engineering the follicle micro environment. Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).
- Ebisch, I. M. W. Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility. Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).
