שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי
Summary
שיטה חדשה אנקפסולציה השחלות זקיק ברשת 3D הפיברין-אלגינט interpenetrating מתואר. מערכת זו משלבת תמיכה מבנית עם השפלה פרוטאוליטי כדי לתמוך בפיתוח של זקיקים בשלים לייצר ביציות בוגרות. שיטה זו עשויה להיות מיושם אגרגטים תא התרבות לשמור תאים תאים מגעים ללא הגבלת ההתרחבות.
Abstract
זקיק בשחלה היא היחידה תפקודית של השחלה כי מפריש הורמוני המין ותומך הבשלת הביצית. בטכניקות זקיק במבחנה לספק כלי להתפתחות זקיק מודל כדי לחקור את הביולוגיה הבסיסית, והם עוד יותר מפותח כטכניקה לשימור פוריות מרפאה 1-4. המערכת שלנו במבחנה תרבות מעסיקה הידרוג על מנת לחקות את הסביבה השחלות יליד ידי שמירה על ארכיטקטורת הזקיקים 3D, תאים תאים אינטראקציות איתות אוטוקריני כי התפתחות זקיק ישיר 5. בעבר, היו זקיקים תרבותי בהצלחה אלגינט, פוליסכריד אינרטי אצות נגזר כי עובר gelation עם יוני סידן 6-8. הידרוג אלגינט נוצר בריכוז של 0.25% w / v היו המתירני ביותר לתרבות זקיק, ושימר את יכולת ההתפתחות הגבוהה ביותר 9. הידרוג אלגינט לא מתכלה, ובכך להגדיל את קוטר תוצאות זקיק בכוח דחיסה על זקיק אשר יכול להשפיע על הצמיחה זקיק 10. לאחר מכן אנו פיתחה מערכת המבוססת על תרבות רשת הפיברין-אלגינט interpenetrating (FA-IPN), שבה תערובת של הפיברין וכן בג'ל אלגינט הם בעת ובעונה אחת. שילוב זה מספק סביבת מכני דינמי כי שני הרכיבים לתרום קשיחות מטריצה בתחילה, אולם פרוטאזות מופרש על ידי הזקיק גדל לבזות הפיברין במטריצה עוזב אלגינט רק כדי לספק תמיכה. עם מהמכון נמסר, התוכן אלגינט יכול להיות מופחת מתחת 0.25%, דבר שאינו אפשרי עם אלגינט לבד 5. לכן, כפי הזקיק מתרחב, זה יהיה ניסיון כוח דחיסה מופחת עקב תוכן מוצקים מופחת. בזאת, אנו מתארים שיטה אנקפסולציה ומערכת במבחנה תרבות זקיקי השחלה בתוך FA-IPN. סביבת מכני דינמי מחקה את הסביבה הטבעית שבה השחלות זקיקים קטנים מתגוררים בקליפת נוקשה ולעבור לשד מתירני יותר כפי שהם גידול בגודל 11. רכיב מתכלה עשוי להיות קריטי במיוחד עבור תרגום קליניים כדי לתמוך יותר מ 10 6 פי הגידול בהיקף כי זקיקי אדם בדרך כלל עוברים in vivo.
Protocol
Discussion
זקיק הציגו השחלות אנקפסולציה השיטה FA-IPN מאפשר תרבות זקיק בסביבת 3D במבחנה. FA-IPN הוא דינאמי, תאים תגובה מטריצה שבו תכונות מכניות הראשוני נקבעים על ידי שילוב של הפיברין והן אלגינט. במהלך התרבות, זקיק במארז מפעיל פרוטאזות כי לבזות רק מרכיב אחד של IPN, את הפיברין, שתוצ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי NIH (U54HD41857 ו PL1EB008542, P30 Biomaterials Core במסגרת קונסורציום Oncofertility מפת הדרכים מענק).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fetuin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | F3385 | ||
| FBS | Invitrogen, Gibco | 10082-139 | ||
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | ||
| CaCl2 | Wako | 039-00475 | 40 mM | |
| EGF | Sigma | A412 | ||
| rFSH | A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases | |||
| hCG | Sigma | CG-5 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | A1603 | ||
| ITS | Sigma | I1884-1VL | ||
| L-15 | Gibco | 11415 | ||
| αMEM+Gluta MAX | Gibco | 32561 | ||
| Pen-Strep | Cellgro | 30-002-CI | ||
| TBS | Pierce | 28379 | ||
| Tisseel Fibrin kit | Baxter | 921030 | ||
| Sodium Alginate | FMC BioPolymers | LF200DL | Mw 418kDa |
Riferimenti
- Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system. Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).
- Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture. Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).
- Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles. Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).
- Smitz, J. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development. Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose. Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).
- Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).
- Xu, M. Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles. Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).
- West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Engineering the follicle micro environment. Seminars in Reproductive Medicine. 25, 287-299 (2007).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).
- Ebisch, I. M. W. Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility. Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).
