Метод инкапсуляции фолликулов яичников и культуры в протеолитически разложению 3 мерной системы

Summary

Новый метод инкапсуляции фолликула яичника в 3D фибрин-альгинат взаимопроникающих сети описывается. Эта система сочетает в себе структурную поддержку с протеолитической деградации, чтобы поддержать развитие незрелых фолликулов для получения зрелых яйцеклеток. Этот метод может быть применен к агрегаты культуры клеток для поддержания межклеточных контактов, не ограничивая экспансию.

Abstract

Яичников фолликул функциональная единица яичников, который выделяет половые гормоны и поддерживает созревания яйцеклетки. В лабораторных методов фолликула предоставить инструмент для моделирования развития фолликула с целью изучения фундаментальной биологии, а далее развивается как метод сохранения фертильности у Клиника ^1-4. Наша культура в пробирке система использует гидрогелей для того, чтобы имитировать родную среду яичников путем поддержания 3D архитектуру, фолликулярная, межклеточных взаимодействий и паракринной понять, что прямое развитие фолликула ^5. Ранее фолликулы были успешно культивируют в альгинат, инертные водорослей полученных полисахарид, желируется с ионами кальция ^6-8. Альгинат гидрогелей образуется при концентрации 0,25% вес / были самыми разрешительной для фолликула культуры, и сохранил высокие развития компетенции ^9. Альгинат гидрогели, не разлагаются, таким образом, увеличение диаметра фолликула приводит к сжимающей силы на фолликул, что может повлиять на рост фолликулов ^10. Мы впоследствии развилась культура система, основанная на фибрин-альгинат взаимопроникающих сети (FA-IPN), в котором смесь фибрина и альгината геля одновременно. Эта комбинация обеспечивает динамический механический окружающую среду, так как компоненты способствуют матрицы жесткости изначально, однако, протеазы выделяются растущие фолликулы ухудшить фибрина в матрицу, оставляя только альгинат оказать поддержку. С IPN, альгинат содержание может быть меньше 0,25%, что невозможно с альгинат только ^5. Таким образом, как фолликула расширяется, он будет испытывать снижение сжимающего усилия в связи с пониженным содержанием твердых веществ. Здесь мы опишем метод инкапсуляции и в пробирке культуру системы фолликулы в FA-IPN. Динамического механического среды имитирует природную среду яичников, в которых небольшие фолликулы находятся в жесткой коре и перейти к более либеральные мозга, как они увеличиваются в размерах ^11. Разложению компонент может быть особенно важно для клинической перевод, чтобы поддержать более 10 ^{6-кратное} увеличение объема, что человеческая фолликулов обычно проходят в естественных условиях.

Protocol

1. Фолликул Изоляция Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Национальным институтом здоровья Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и созданы институциональные Использование ж?…

Discussion

Представлены фолликула яичника метод инкапсуляции в FA-IPN позволяет фолликула культуры в 3D-среде в пробирке. FA-ВПС является динамическим, сотовых проблематику матрицу, в которой начальная механические свойства которых определяются комбинацией обоих фибрина и альгината. В культур?…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Fetuin		Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F3385
FBS		Invitrogen, Gibco	10082-139
Aprotinin		Roche	10236624001
CaCl2		Wako	039-00475	40 mM
EGF		Sigma	A412
rFSH		A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG		Sigma	CG-5
Hyaluronidase		Sigma	A1603
ITS		Sigma	I1884-1VL
L-15		Gibco	11415
αMEM+Gluta MAX		Gibco	32561
Pen-Strep		Cellgro	30-002-CI
TBS		Pierce	28379
Tisseel Fibrin kit		Baxter	921030
Sodium Alginate		FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa