En metod för äggblåsa Inkapsling och kultur i ett Proteolytically Nedbrytbara 3 dimensionellt system

Summary

En ny metod för äggblåsa inkapsling i en 3D fibrin-alginat genomträngande nätverk beskrivs. Detta system kombinerar strukturellt stöd med proteolytisk nedbrytning för att stödja utvecklingen av omogna folliklar att producera mogna ägg. Denna metod kan tillämpas på aggregaten kultur cellen att upprätthålla cell-cell kontakter utan att begränsa expansionen.

Abstract

Äggstocksfollikeln är funktionell enhet av äggstocken utsöndrar könshormoner och stöder äggcellen mognad. I tekniker vitro follikelstimulerande ett verktyg för att modellera follikelutveckling för att undersöka grundläggande biologi, och ytterligare utvecklas som en teknik för att bevara fertiliteten i klinik ^1-4. Vår in vitro-kultur-systemet använder hydrogeler för att efterlikna den infödda äggstockarna miljön genom att bevara 3D follikulära arkitektur, cell-cell interaktioner och parakrina signalerar att direkt follikelutveckling ^5. Tidigare var folliklar med framgång odlas i alginat, ett inert alger-derived polysackarid som genomgår gelation med kalciumjoner ^6-8. Alginat hydrogeler bildas vid en koncentration av 0,25% w / v var de mest tillåtande för follikelstimulerande kultur och behöll den högsta utvecklande kompetens ^9. Alginat hydrogel är inte nedbrytbara, alltså en ökning av resultatet follikeln diametern i en tryckkraft på follikeln som kan påverka tillväxten av folliklar ^10. Vi utvecklade därefter en kultur som bygger på en fibrin-alginat genomträngande nätverk (FA-IPN), där en blandning av fibrin och alginat är geléartad samtidigt. Denna kombination ger en dynamisk mekanisk miljö eftersom båda komponenterna bidrar till matrisen styvhet initialt, men proteaser som utsöndras av den växande follikeln bryts fibrin i matrisen lämnar endast alginat att ge stöd. Med IPN, kan alginat halten vara mindre än 0,25%, vilket inte är möjligt med alginat ensam ^5. Således, eftersom follikeln växer, kommer det att uppleva en reducerad tryckkraft på grund av minskad halt. Häri beskriver vi en inkapsling metod och en in vitro-kultur för folliklar i en FA-IPN. Den dynamiska mekaniska miljö efterliknar naturliga äggstockarna miljö där små folliklar bor i en stel cortex och flytta till en mer tillåtande medulla som de ökar i storlek ^11. Den nedbrytbara delen kan vara särskilt kritiskt för klinisk översättning i syfte att stödja mer än 10 ^6-faldig ökning i volym att de mänskliga folliklar normalt genomgå in vivo.

Protocol

1. Follikelstimulerande Isolering Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur och den etablerade institutionella Animal Användning och skötsel protokoll vid Northwestern University. För bästa resultat är alla dissektioner utförs i L15 media för pH-kontroll i omgivande nivåer av CO 2, på 37 ° C värms upp steg för temperatu…

Discussion

De presenterade äggblåsa inkapsling metod i en FA-IPN gör follikeln kultur i en 3D-miljö in vitro. En FA-IPN är en dynamisk, cell-lyhörd matris där den första mekaniska egenskaper bestäms av en kombination av både fibrin och alginat. Under kultur, aktiverar inkapslade follikeln proteaser att försämra bara en del av IPN, det fibrin, vilket resulterar i ett gradvis minskande gel styvhet som bidrog endast av den återstående alginat i slutet av kulturen. Den dynamiska mekaniska egenskaper uppnås med …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Fetuin		Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F3385
FBS		Invitrogen, Gibco	10082-139
Aprotinin		Roche	10236624001
CaCl2		Wako	039-00475	40 mM
EGF		Sigma	A412
rFSH		A.F. Parlow, National Hormone and Peptide Program, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases
hCG		Sigma	CG-5
Hyaluronidase		Sigma	A1603
ITS		Sigma	I1884-1VL
L-15		Gibco	11415
αMEM+Gluta MAX		Gibco	32561
Pen-Strep		Cellgro	30-002-CI
TBS		Pierce	28379
Tisseel Fibrin kit		Baxter	921030
Sodium Alginate		FMC BioPolymers	LF200DL	Mw 418kDa