<p class="jove_content"<strong> Materiais necessários:</strong> Dissection estereomicroscópio, fita dupla face, lâmina de microscópio padrão e lamínula, pinça de dissecção (tamanho 5 ou 5.5), escova de cerdas macias, graxa de silicone a vácuo, seringa 5cc, papel Whatman, ou confocal microscópio de epifluorescência, com câmera digital e imagem software de aquisição.</p><p class="jove_title"> 1. Dissecação de pupa</p><ol><li> Estabelecer uma cruz (usando a combinação apropriada de Gal4 linha e uma proteína de fusão GFP tagged sob controle UAS) ou moscas lugar a partir de um estoque que você deseja para a imagem em vários frascos fresco a 25 ° C.</li><li> Células SOP geralmente começam a proliferar no tórax pupal em 18 horas após o início da pupariation, nós, portanto, selecionar pupas "branco" do estoque voar apropriado ou cruz. Branco pupas têm a morfologia pupal, mas têm um caso unpigmented pupal, indicando que que pupariated dentro da hora.</li><li> Espere aproximadamente 18 horas.</li><li> Coloque um pedaço de fita dupla-face para o slide. Coletar pupas e aderir caso pupal para a fita dupla-face com o lado ventral para baixo. Segure a borda do opérculo (a escotilha circular na ponta dorsal anterior do caso de pupa) com a pinça</li><li> Levante cuidadosamente, remover e descartar o opérculo, revelando a cabeça da mosca imaturo.</li><li> Use a pinça para começar a rasgar ao longo do lado do caso pupal. Levante a secção central do caso pupal do lado rasgado e trazê-lo para o lado oposto, ou removê-lo completamente ou anexá-lo à fita, revelando a porção anterior do tórax e do abdômen. (<strongnota></strong>: Existe uma lacuna entre a voar em desenvolvimento e caso pupal. Tenha cuidado para não perfurar a voar como a parede da caixa é rasgada.)</li><li> Comece cortando ao longo do mesmo lado do caso pupal para o fim posterior. Mais uma vez, tome cuidado para não perfurar a voar. Puxe o caso pupal para o lado oposto da mosca e pressione-o para a fita dupla face. O abdômen deve estar totalmente exposta. Coloque a escova de cerdas macias diretamente abaixo da cabeça da mosca. Uma vez que a mosca está presa ao pincel e livre do caso de pupa, use a escova para levantar delicadamente a voar fora do slide.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Montagem de pupa</p><p class="jove_content"> Após a dissecção, pupas são então montadas entre lâmina e lamínula:</p><ol start="8"><li> Pupas Isolated removido caso pode então ser colocado no centro de um lado dorsal de vidro deslizar para cima.</li><li> Faça uma moldura quadrada de papel Whatman 18X18mm deixando uma abertura de 10×10 mm no meio. Papel mergulhe em água até à saturação. Lugar em torno da pupa.</li><li> Usando uma seringa de 5 cc preenchido com graxa de vácuo silicone, aplique uma camada uniforme de gordura ao redor da moldura Whatman. A camada de graxa deve caber dentro da lamela (Figura 1) ea espessura deve ser apenas um pouco maior que o diâmetro de pupa.</li><li> Coloque uma pequena gota de água (1 ml) no centro de uma lamela 22×22 milímetros e coloque a lamínula sobre a preparação acima de tal forma que os contatos pequena gota de água da superfície que você deseja notum imagem, neste caso). Comprimir delicadamente para formar uma vedação de graxa de vácuo e superfície de contato plana entre as lamelas e cutícula pupal.</li><li> Prep pode então ser trabalhada em microcopes invertido ou vertical, usando epifluorecence, confocal (varredura a laser ou spinning tipo de disco) ou confocal de dois fótons. Se você for cuidadoso, moscas adultas podem ser recuperadas depois de vários dias.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Resultados representativos:</p><p class="jove_content"> Usando uma linha de SOP específico Gal4 (<em> Neuralized</em>-Gal4) cruzou a proteínas GFP marcadas para rotular o fuso mitótico (tubulina ou Tau-GFP) ou proteínas histonas (H2B-GFP), pode-se observar avião divisão da SOP divisão celular, o comprimento do ciclo celular, ou o número de mitose divisões usando lapso de tempo de imagem<sup> 9</sup>. Outras proteínas de fusão que visam organelas celulares como Rab-GTPases para marcar diferentes compartimentos endocítica (Rab5-GFP para o início de endossomos ou Rab11 GFP para reciclagem endossomos) ou proteínas importantes na regulação de sinalização Notch (Numb, sócio da Numb-GFP, ou Sanpodo -GFP) pode gerar importantes insights sobre os mecanismos de divisão celular assimétrica e tráfico de proteína de membrana<sup> 2,3,7,10,11</sup>.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Figura 1: dissecção pupa e montagem. A.</strong> Passo-a-passo imagens mostram o procedimento para remover o caso pupal e preparar pupas intactas para imagens de células de montagem e ao vivo. Pupas são removidos do frasco e colocadas, lado dorsal para cima, em fita dupla pau anexado a uma lâmina de vidro. Primeira coluna, a remoção do opérculo e rasgando ao longo do lado do caso pupal. Segunda coluna, a remoção do caso pupal da região torácica e abdominal. A pupa livre é, então, levantada a partir do caso pupal usando uma escova de cerdas macias.<strong> B.</strong> Montagem pupas entre lâmina e lamínula. Pupa é colocado dorsal do lado em cima da lâmina de vidro, rodeado por uma moldura de papel Whatman umedecido. Um cordão contínuo de silicone graxa de vácuo extrudados a partir de uma seringa 5cc funções para selar a combinação de slides lamela, protegendo a pupa de dessecação e elevando a lamela por isso descansa suavemente sobre o tórax pupal. Uma pequena gota de água (1 ml) na interface entre as lamelas e cutícula tórax melhora significativamente a qualidade da imagem quando usar objetivas de imersão (água ou óleo).<a href="http://www.jove.com/it/files/ftp_upload/2706/2706fig1_large.jpg/"> Clique aqui para ver uma imagem maior</a>.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figura 2: Imagens representativas de células SOP viver e externa diferenciada órgãos sensoriais tomadas usando nosso dissecção pupal e montagem procedimento. A</strong>. Imagens extraídas de uma série temporal de uma célula mitótica SOP expressar actina-proteína de fusão GFP sob o controle do<em> Neuralized-</em> Gal4 (<em> Neur-</em> Gal4/UAS-actin-GFP), note acúmulo de actina cortical no sulco de clivagem (1 image / a cada 2 minutos).<strong> B</strong>. Células-filhas SOP co-expressando Parceiro de Numb-RFP (vermelho) e Rab5-GFP impulsionado por<em> Neuralized-</em> Gal4, observe a distribuição assimétrica de Pon-RFP em uma célula-filha (pIIb) e distribuição de endossomos iniciais em ambas as células-filhas.<strong> C</strong>. Renderização de volume de um z-series consideração diferenciada externa órgãos sensoriais numa fase tardia pupal. Estruturas de cutícula, como mechnosensory cerdas e pêlos epidérmicos são revelados por cutícula autofluorescência (vermelho). Além disso, usamos o sistema MARCM para expressar LGL-GFP (dirigido por<em> Neuralized-</em> Gal4) em um subconjunto de células sensoriais do órgão precursor (verde). (Estas imagens foram adquiridas usando uma Nikon C1 microscópio de varredura confocal usando um objetivo 60X 1,45 NA)</p>