在 C 在体内激光干切断线虫

Summary

减少神经元的协议<em> C。线虫</em>与MicroPoint脉冲激光。我们描述了建立该系统，固定蠕虫，并切断标记的神经元。优势包括成本相对较低的系统和能力，切断神经元突起或消融细胞<em>在体内</em>。

Abstract

神经元与其他细胞通过轴突和树突，修长的膜扩展，包含前或突触后专业沟通。如果一个神经元受到伤害或疾病受损，可能会再生。细胞内在和外在因素的影响，神经元的再生能力和恢复功能。近日，线虫C.线虫已经成为一个很好的模式生物基因识别和信号转导通路，影响神经元^1-6的再生。启动C.神经再生的主要途径线虫是介导的激光切割，或干切断。干切断期间，一个荧光标记的神经元过程中使用高能量的脉冲被切断。起初， 在 C中的神经再生线虫是研究用放大飞秒激光^5。然而，随后的再生的研究表明，传统的脉冲激光可以用于准确地切断神经元在体内，并引起了类似^的再生反应1,3,7。

我们目前在体内的激光干切断表演的协议，在使用MicroPoint脉冲激光，交钥匙系统，是现成的，并已被广泛用于细胞进行有针对性的消融的蠕虫。我们描述的激光对准，安装蠕虫，切割特定神经元，并评估后续再生。该系统提供的能力在一项实验中削减多个蠕虫的神经元大量。因此，激光干切断本文所述的是一个高效的系统启动和分析的再生过程。

Protocol

1。组装系统下面列出了我们系统的具体组成部分。正确组装时，用户应该能够集中精力，用一只手的显微镜，将与其他阶段（或者用鼠标或操纵杆），激活与脚踏板的激光，并有一个明确的说法屏幕图像。 MicroPoint激光装到一个复式显微镜落射荧光港口。我们使用尼康80I，但任何研究级直立或倒置的范围应工作。 MicroPoint系统将包括一个自定义的分色，这应该与荧光标记的细胞，你希望削减。切割与替代荧光团标记的细胞额外dichroics。此外，脉冲发生器和脚踏板来与MicroPoint系统。 100倍，1.4 NA手术和评估再生石油的目标，再加上必要的额外的目标定位在幻灯片上的样品。我们对手术中使用尼康计划阿婆VC，发现粗的重点，发现样品，4X是有用的。 机动与操纵杆的阶段。具有极高的精度和可重复性的一个阶段是不必要的，因为只为目标阶段。我们使用之前OPTISCAN II（见讨论）。 相机。相机的需求，以提供足够的帧速率，标记的突起与100X目标，重点和目标，而可视化在计算机显示器上的形象。我们喜欢干切断过程的衰减过程中的照明灯，从照片褪色或损坏（见，低于1.7），以避免潜在的混杂影响。因此，相机的需求不够敏感，以适应这种减少光照水平。我们使用滨松ORCA 05G，并发现，在16.3赫兹成像足够。同样的相机可以被替换。 计算机，显示器和图像处理软件，可以驱动摄像头。此外，我们使用图像处理软件，用鼠标操作的机动阶段（见讨论）。 空气球台。此要求可能会有所不同位置而有所不同，但因为手术是用100X目标，我们发现振动隔离是必不可少的。 光照明的荧光光导和快门机制供应。光导会重视的MicroPoint。快门机制是很有用的独立的激光，以减少光照强度的。我们使用一个200流明之前或徕卡EL6000，衰减高达80％的总的光强度为干切断。 2。激光设置 MicroPoint激光系统提供一个详细的协议，初步调整和重点激光。我们假设一直遵循这一程序在初始安装成功。这包括使在目镜的十字线激光。在这里，我们提供了一个协议定期保养激光的重点和力度。 在MicroPoint手册中指出，脉冲氮激光是严重损害人的眼睛的能力。应小心，切勿直视激光束直接。一旦安装完毕，应安全地阻止屏障过滤器通过目镜辐射。 一粒沙子的大小，切割在一个生物体的神经细胞可以是具有挑战性。由于激光所造成的损害的面积很小，这是必须要知道，正是以目标样本三维激光的焦点位置。激光的重点是发现使用镜像幻灯片。首先，我们检查，激光聚焦的Z位置相匹配的成像路径的焦点。下一步，XY位置的损害的重点是与成像软件十字线标记。 重点在z平面推中性密度滤光镜ND16（图1a）。我们使用中性密度滤光片，在外延照明路径衰减的激光，同时注重。更精细的重点，推动两个ND16和ND4基因荧光过滤器。 与交换机的设置MicroPoint 1个脉冲的激光打开“选择”（图1b），然后移动过滤器轮适当的通长的屏障过滤器（图1c）。 将在舞台上的镜像的幻灯片和4X使用透射光的目标集中在它的针孔。 浸油下降到镜像的幻灯片，并重新调整与100X目标的针孔。打开相机的快门与光开关杆（图1d）和激光快门（图1e）的路径。如果有必要，减少透射光强度，使针孔边缘清晰：这将有助于完全集中。 按下脚踏板。这应该产生一个在镜子里的小洞，如果激光聚焦正确。 略高于平面镜像幻灯片聚焦显微镜，并再次发射激光。这应该使一个更小的孔比第一枪，或没有留下任何印记。重复下面的镜像幻灯片的重点。 如果没有一个洞是在2.5，如果高于或低于重点镜面时产生一个更大的洞，重新调整与激光消融头的对焦环。验证该洞仍然是正确与目镜十字线对准。 z平面的重点一致的使用，很少需要进行调整。 聚焦在XY平面上按照2.1到2.3以上的步骤，并按下脚踏板，使镜中的幻灯片的一个小孔。 启动“活”捕捉模式从要素“收购”菜单。在“测量”工具栏上选择“投资回报率主编的”，然后选择“双十字”工具拖动十字线，以配合新孔的中心。点击“保存的投资回报率”，然后“退出编辑器”，并恢复实时捕捉模式。 激活元素中的“设置鼠标的XY”，用鼠标操作的阶段。 中性密度​​滤光镜（S）拉回到原来的位置（S），到10集的激光脉冲，并删除镜像幻灯片。 调整激光功率应调整，以减少您所选择的神经元所需的最低功率的激光功率。调整移动衰减器板（图1F），同时削减生活蠕虫（如下所述）的功率。如果激光功率过高，它会引起周围的损害或爆炸蠕虫洞。如果激光功率过低，不会切断神经元。一旦系统已成立，衰减器的位置很少需要改变。如果激光变弱，需要衰减器板块移动继续切割，它可能是一个迹象，需要更换（见讨论），染料在染料细胞。 3。固定的蠕虫准备了3％M9的熔融在琼脂糖（磷酸二氢钾22MM，42MM的Na2HPO4，85MM氯化钠，硫酸镁1MM）的解决方案。分送熔化琼脂糖5毫升到15毫升猎鹰管。填写另一个管水。放置在一个模块化的加热元件管设置为55 ° C装满水的加热元件来创建每管的微型水浴。注：琼脂糖可以提前准备大量的后续实验重新回炉。 每两张幻灯片，这些幻灯片之间的一个干净的幻灯片放在两层标签磁带。分配一个干净的幻灯片和另一张幻灯片的第一次，造成的琼脂糖凝胶垫使是两件磁带的厚度（图2）垂直的中间用一个塑料球吸管琼脂糖下降。从垫在30秒后取出两张幻灯片。冲洗和存放在装满水的猎鹰管与随后的幻灯片使用的塑料吸管。 下一步，放置3-5微升0.10微米或0.05微米的聚苯乙烯珠垫的中心。添加感兴趣的神经元中表达荧光蛋白的5-10蠕虫。如果感兴趣的神经元是不对称分布的右边或左边的蠕虫，使用铂金拿起，翻转，使正确的一面是朝上的蠕虫。蠕虫必须放在准备琼脂糖垫在10分钟的幻灯片。 小心地将盖玻片上的蠕虫。放置盖玻片后，不要动它相对的琼脂糖凝胶垫，因为这会破坏角质层和破坏的蠕虫。放置在显微镜舞台上的准备幻灯片。 4。切断神经元光线直接进入光路切换杆的目镜。重点要削减与4X目标的蠕虫，地方的盖玻片上的油下降，并切换到100X的目标。返回到相机的光路。 使用鼠标移动到您所选择的神经元，下十字线的中心。按脚踏火激光切断的神经元的过程。如果需要，可以使用两套脉冲切断的神经元。首先，它是有帮助的精确跟踪神经元有个别蠕虫切断，以评估后续再生。当正确执行，激光干切断生产不造成重大损害周围的皮肤组织或其他神经元（见图3）的情况下一个神经元的小破。在某些情况下，可能会形成一个小的疤痕周围损伤的部位。 收回的蠕虫取出盖玻片直接向上运动，小心蠕虫琼脂糖垫。不要滑动盖玻片。然后，切开尖嘴钳的蠕虫周围垫和放置新鲜种子NGM板OP50 8节琼脂糖。放在垫10μL无菌M9摆脱珠的蠕虫和去除琼脂糖。 5。分数再生神经元在步骤2.2中所述，准备琼脂糖垫。 在3-5及广场的蠕虫万亩; L的聚苯乙烯珠。应用盖玻片。可以按顺序准备幻灯片，或者所有的蠕虫可以在推进，并保持在10厘米的培养皿中，每个都含有保持琼脂糖湿润潮湿Kimwipe幻灯片准备。 使用100X的目标形象化切断的神经元。在许多神经元，神经断端远端切站点将保持不变。我们使用这残余的存在，作为一个神经元确实切断（图4）的指示。这个残端的存在，使我们能够区分出已被切断，从一个不会削减再生神经元。注：无论是远端和近端的树桩最初被切断后收回。 评估再生。各种参数才能确定。一个简单的实验是受伤的神经元是否已形成一个生长锥（图4a）和再生的，或不（图4b）。此外，突起的长度可以被追踪和比较。 6。代表性的成果作为一个例子，我们描述的γ-氨基丁酸（GABA）的运动神经元再生的特性。这些神经元，其中居住在腹神经索和扩展过程圆周背神经索，是必要的适当运动9。 GABA的神经细胞可以表达一个基因编码的荧光基团，如绿色荧光蛋白（GFP），可视化，控制下的联合国军司令部 -47或UNC的-25促销员（株EG1285和CZ1200， 分别可从线虫遗传中心）。 山L4阶段蠕虫描述的那样，翻转蠕虫，所以在他们的左右两侧的GABA神经元朝上，并将其放置盖玻片。切割后，在每一个蠕虫病毒，背，腹线之间的中途commissures 1-3。避免削减commissures交叉或与其他commissures，因为这些fasciculate以后难以得分。恢复所述的蠕虫。 一个成功的干切断后18至24小时，蠕虫会从手术中恢复，并表现出正常的locomotory和产蛋行为。丢弃死亡或生病的蠕虫。重新装入其余部分所描述的那样，评估再生。我们通常的目的是评估至少有30％的实验条件下切断神经元。 oxIs12动物，切断L4 GABA的神经元通常是60-70％，将发起一个生长锥的结构，扩大膜的一角和几个突起分行的延伸，并从削减站点（图4a）迁移证明。在许多情况下，生长锥​​将迁移到重新与背神经索，相邻的神经元合缝，或远侧断端。其余30％的神经元将发起没有增长，形成一个树桩近端干切断网站，或将延长只小的丝状伪足（图4b）。 图1。紫外线脉冲激光干切断系统 。具体内容是：（一）ND滤镜（二）脉冲选择（C）滤光轮杆（D）光路开关杆（E）激光快门和（F）衰减器板。 图2。准备琼脂糖垫 。为了准备所需的厚度的琼脂糖垫，两层胶带（绿色）被放置在两个幻灯片。前两个幻灯片之间放置，和琼脂糖下降，然后添加到干净的幻灯片。最后，第四个幻灯片是垂直放置的前三个，导致在一垫就是两件磁带的厚度。 图3。代表GABA的神经元axotomies。在一个典型的实验中，GABA的神经元commissures蠕虫的侧面中间被切断。一个割断合缝立即前（左图）和（右图）干切断后。 100X油目标所采取的所有图像。 图4。 GABA的神经元axotomies代表性的结果 。 24小时后干切断切断轴突再生取得。与再生轴突的生长锥（箭头）（a）在非再生轴突近端残端（箭头）（b）中所示。每个切断轴突的远侧断端显示在每个面板（箭头），是轴突被切断的迹象。

Discussion

各种激光系统已被用于削减在 C突起在详细^3,7,10,11研究他们的表现， 线虫和一些研究。 MicroPoint在我们​​的协议中使用的激光是一个交钥匙系统，容易设置和维护，并以较低的成本相比，一个钛蓝宝石激光系统的研究人员提供。然而，一个钛蓝宝石系统相比，预计MicroPoint激光造成损坏面积较大，这可能对一些应用程序不利。如果需要一个钛蓝宝石系统，建设这样一个系统的一个很好的协议^是提供12。

目前的协议，可以执行各种不同的神经元在C 线虫 ，但是，我们注意到，在不同类型的神经元之间的再生能力的差异^，预计13。此外，不同的基因背景可以影响再生成功。虽然GABA的神经元再生的比例是相当不同的转基因标记菌株之间的一致，我们已经注意到在再生的整体 ^略有增加， ^与 oxIs12 15蠕虫juIs76 14。触摸神经元的标记之间的差异^也被描述2。

我们喜欢固定与微球，而不是麻醉药的蠕虫，如珠导致更快和更一致^的固定16。这也是有利的，因为我们能够观察到任何可能^由于麻醉17混杂影响的再生。另一种麻醉无固定的方法是使用微流体装置。已被广泛使用干切断微流体描述^17-22。

我们发现，一致的使用，激光功能的最佳时香豆素染料单元440改为每周一次以下MicroPoint手册中所述的程序。如果有必要，可以使用衰减滑块，增加功率，但是这可能是一个旧的染料或激光错位的迹象。此外，染料的细胞有一个有限的寿命，并最终将需要进行重建或替换（请参阅排除）。

它可能很难操纵下十字线，标志着激光聚焦的目标突起，特别是如果动物是不完全瘫痪。我们发现，手工阶段是不为这一目的的最佳，但它肯定是可用。一个操纵杆控制机动阶段是更精确，我们发现，使用的软件，支持图像拖动鼠标移动的机动阶段是最好的。尼康元素提供此功能，并在本协议中所述，但事无巨细的免费软件包，以及其他图像处理软件，可能也有类似的功能。精细定位的一个不同的方式，是将激光聚焦，而不是动物。阿振光束控制机制可作为一个MicroPoint激光添加，如果这种方法是首选。

除了 ​​神经再生的研究及其应用，激光可用于消融其他类型的细胞，如皮肤，肌肉，或专门的细胞，或破坏特定的神经^元突触23-27。此外，规范附带伤害或疾病的神经元退化的途径，这个系统可以进行调查。因此，使用脉冲激光器将继续揭示遗传因素和细胞生物学的变化，促进神经再生和其他相关进程。

故障排除：

这里描述的一些常见问题及其相关的解决方案。

1. 激光切割不正确 。这可能是因为无论是激光的重点（见第2节），或染料在染料细胞需要更换（见MicroPoint手册）。另外，染料电池可能需要更换或重建。
2. 蠕虫正在琼脂糖垫 。这通常是一个符号，琼脂糖垫太潮湿。我们发现垫需要约30秒钟，而后虫放在他们绕过这个问题。您也可以尝试使用较小的尺寸（0.05微米）微球。
3. 蠕虫的恢复是困难和效率低下。这可能是造成不正确的盖玻片拆除或干琼脂糖垫。如果垫过于干燥，您可能会注意到轴突发展串珠的外观。在某些情况下，这是因为蠕虫不放在垫后，它是很快。另外，老股票的琼脂糖溶液可能有反复融化后的浓度高于3％。

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
0.05 μm Polystyrene Beads	Polysciences, Inc.	08691
0.10 μm Polystyrene Beads	Polysciences, Inc.	00876
Agarose GPG/LE	American Bioanalytical	00972	Ultra pure
Falcon 14 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	BD Biosciences	352057	17 x 100 mm style, nonpyrogenic
Thermo Scientific Plain precleaned microscope slides	Erie Scientific Company	420-004T	3″ x 1″ x 1 mm
Cover Slips	VWR	48366 205	18 mm x 18 mm No. 1 1/2
KIMTECH Science Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
BD Falcon 100 x 15mm Style Petri Dish	BD Biosciences	351029
Tape blank 3/4w x 500L	TimeMed	T-512
Immersion oil	Nikon		Type A, nd=1.515
EG1285 or CZ1200	C. elegans Genetic Center	http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/
OptiScan II	PRIOR Scientific
NIS-Elements Ar or Br	Nikon
MicroPoint Ablation Laser System	Photonic Scientific
Compound microscope	Nikon	Eclipse 80i
Hamamatsu Camera	Hamamatsu Photonics	Model C8484-05G01
Dell Precision T3400 PC with Intel Core 2 Duo	Dell
Windows XP Professional		Microsoft	Version 2002, Series Pack 3
Dual dry bath Incubator	Fisher Scientific		Analog controls
4X Plan Fluor objective	Nikon
100X Plan Apo VC oil objective	Nikon
Dumont #5/45 forceps	Dumont	11251-35	Dumoxel standard tips, can also use #7
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ800	With NI-150 High Intensity Illuminator