Meting van Aggregate samenhang door weefseloppervlak Tensiometry

Summary

We beschrijven een methode voor het meten bindingsenergie, worden uitgedrukt als weefsel oppervlaktespanning, tussen de cellen in 3D weefsel-achtige aggregaten. Verschillen in weefsel oppervlaktespanning is aangetoond dat zij correleren met invasiviteit van de longen, de spieren, en hersentumoren, en zijn fundamentele determinanten van oprichting van ruimtelijke relaties tussen de verschillende celtypen.

Abstract

Strenge meting van intercellulaire bindingsenergie kan alleen gemaakt worden met behulp van methoden gebaseerd op thermodynamische principes in de systemen bij evenwicht. We hebben ontwikkeld weefseloppervlak tensiometry (TST) specifiek aan de oppervlakte vrije energie van de interactie tussen de cellen te meten. De biofysische concepten ten grondslag liggen aan TST zijn eerder in detail beschreven ^1,2. De methode is gebaseerd op de observatie dat onderling samenhangende cellen, indien gehandhaafd in schudden cultuur, spontaan assembleren in clusters. Na verloop van tijd zullen deze clusters rond tot bollen vormen. Deze afronding-up gedrag imiteert het gedrag een kenmerk van vloeibaar-systemen. Intercellulaire binding energie wordt gemeten door het comprimeren van bolvormige aggregaten tussen parallelle platen in een speciaal ontworpen weefseloppervlak tensiometer. Dezelfde wiskundige vergelijking gebruikt om de oppervlaktespanning van een vloeistof druppel maatregel wordt gebruikt om de oppervlaktespanning van 3D weefsel-achtige bolvormige aggregaten te meten. De cellulaire equivalent van vloeibare oppervlaktespanning is intercellulaire bindingsenergie, of meer algemeen, weefsel cohesivity. Eerdere studies van ons laboratorium hebben aangetoond dat weefsel oppervlaktespanning (1) voorspelt hoe de twee groepen van embryonale cellen met elkaar ^1-5, (2) kan een sterke invloed van het vermogen van weefsels om te interageren met biomaterialen ^6, (3) kan worden veranderd, niet alleen door directe manipulatie van cadherine-based intercellulaire cohesie ^7, maar ook door manipulatie van de belangrijkste ECM moleculen zoals FN ^8-11 en 4) correleert met invasieve potentieel van longkanker ^12, fibrosarcoom ^13, hersentumor ¹⁴ en prostaat tumor cellijnen ^15. In dit artikel beschrijven we het apparaat, detail de stappen die nodig zijn om sferoïden te genereren, om de sferoïden te laden in de tensiometer kamer, te aggregeren compressie gang te brengen en te analyseren en valideren van het weefsel oppervlak gegenereerde spanning metingen.

Protocol

1. Totale voorbereiding voor het meten van weefsel oppervlaktespanning. Voor hechtende cellen, kan sferoïden worden gevormd door met behulp van de opknoping neerzetten of door het genereren van een coherente plaat van cellen die vervolgens kan worden gesneden in 1 mm fragmenten. Totale formatie van de opknoping neerzetten: Near-samenvloeiende adherente celkweken moeten worden gekweekt tot 90% confluentie, dient waarna monolagen twee keer gespoeld met PBS…

Discussion

Het meten van de totale samenhang door TST is relatief eenvoudig. Er zijn echter belangrijke stappen die moeten worden beheerst om bruikbare TST gegevens te produceren; 1) aggregaten moeten zijn "gezond". Dit kan worden gecontroleerd door ervoor te zorgen dat de totale formatie begint met cellen die zijn op een optimale samenvloeiing voorafgaand aan de onthechting. Aggregate omvang en tijd in cultuur moet ook worden gecontroleerd om de ontwikkeling van een necrotische kern binnen de totale minimum te beperken,…

Materials

• water bath/shaker (New Brunswick Scientific, Edison, NJ)
• 10 ml round-bottom flasks (Belco, Vineland, NJ)