Mätning av Aggregate sammanhållning genom vävnadsytan tensiometri

Summary

Vi beskriver en metod för att mäta bindningsenergi, expressible som vävnad ytspänning, mellan celler inom 3D vävnad-liknande aggregat. Skillnader i vävnaden ytspänning har visat sig korrelera med invasivitet av lung-, muskel, och hjärntumörer, och är grundläggande faktorer för upprättande av rumsliga relationer mellan olika celltyper.

Abstract

Rigorös mätning av intercellulära bindande energi kan endast göras med metoder som bottnar i termodynamiska principer i system vid jämvikt. Vi har utvecklat tensiometri vävnadsytan (TST) specifikt för att mäta ytan fria energi av interaktionen mellan celler. Det biofysiska begrepp som underbygger TST har tidigare beskrivits i detalj ^1,2. Metoden bygger på iakttagelsen att ömsesidigt sammanhängande celler, om upprätthålls i skakning kultur, spontant kommer att montera in kluster. Med tiden kommer dessa kluster runda upp för att bilda sfärer. Denna avrundning uppåt beteende härmar beteendet karaktäristiskt för flytande system. Intercellulära bindningsenergi mäts genom att komprimera sfäriska aggregat mellan parallella plattorna i en specialdesignad vävnadsytan tensiometer. Samma matematisk ekvation som används för att mäta ytspänningen i en flytande droppe används för att mäta ytspänning 3D vävnad-liknande sfäriska aggregat. Det cellulära motsvarande flytande ytspänningen är intercellulära bindande energi, eller mer allmänt, vävnad cohesivity. Tidigare studier från vårt laboratorium har visat att vävnad ytspänning (1) förutsäger hur två grupper av embryonala celler kommer att interagera med varandra ^1-5, (2) kan starkt påverka förmågan av vävnader att interagera med biomaterial ^6, (3) kan ändras inte bara genom direkt manipulation av cadherin-baserade intercellulära sammanhållning ^7, men också genom manipulation av viktiga ECM-molekyler såsom FN ^8-11 och 4) korrelerar med invasiv potential lungcancer ^12, fibrosarkom ^13, hjärntumör ¹⁴ och prostata tumör cellinjer ^15. I denna artikel kommer vi att beskriva apparaten, detalj de åtgärder som krävs för att generera spheroids, för att ladda spheroids i tensiometer kammaren, att inleda samlade kompression, och att analysera och validera vävnaden ytspänningen genereras mätningar.

Protocol

1. Aggregate förberedelse för mätning av vävnad ytspänning. För anhängare celler kan spheroids bildas med hjälp av antingen den hängande släpp-metoden eller genom att generera en sammanhängande blad av celler som sedan kan skäras i 1 mm fragment. Samlade bildandet av droppe metoden: Nära-sammanflytande anhängare cellkulturer bör odlas till 90% sammanflödet bör varefter monolager sköljas två gånger med PBS. Efter dränering väl, tills?…

Discussion

Mätning av totala sammanhållningen av TST är relativt enkelt. Det finns dock viktiga steg som måste bemästras för att skapa användbara TST uppgifter, 1) aggregat måste vara "frisk". Detta kan kontrolleras genom att sammanlagda bildningen börjar med celler som är optimalt sammanflödet före avskiljandet. Sammanlagda storlek och tid i kulturen måste också kontrolleras för att minimera utvecklingen av en nekrotisk kärna inom den sammanlagda, 2) En annan parameter som kan påverka TST mätningar är…

Materials

• water bath/shaker (New Brunswick Scientific, Edison, NJ)
• 10 ml round-bottom flasks (Belco, Vineland, NJ)