'Bioluminescent' Reporter Faag voor de detectie van categorie A bacteriële pathogenen
Summary
Een eenvoudige methode voor de identificatie van de prioritaire bacteriële pathogenen is het gebruik van genetisch gemanipuleerd reporter faag. Deze verslaggever faag, die specifiek zijn voor hun specifieke gastheer soorten, zijn in staat om snel transduceren een lichtgevend signaal naar aanleiding van gastheercellen. Hierin beschrijven we het gebruik van de reporter faag voor de detectie van<em> Yersinia pestis</em>.
Abstract
Yersinia pestis en Bacillus anthracis zijn categorie A bacteriële ziekteverwekkers die de verwekkers van de pest en anthrax, respectievelijk 1. Hoewel de natuurlijke aanwezigheid van beide ziekten 'is nu relatief zeldzaam, de mogelijkheid van terroristische groeperingen gebruik van deze pathogenen als een biowapen is echt. Vanwege de ziekte die inherent zijn besmettingsgevaar, snelle beloop, en een hoge mortaliteit, is het essentieel dat een uitbraak snel kan worden opgespoord. Daarom methodologieën die een snelle opsporing en diagnose te bieden zijn essentieel voor de onmiddellijke uitvoering van public health maatregelen en de activering van de crisisbeheersing te garanderen.
Recombinant verslaggever faag kunnen voorzien in een snelle en specifieke aanpak voor de detectie van Y. pestis en B. anthracis. De Centers for Disease Control and Prevention op dit moment gebruik maken van de klassieke faag lyse assays voor de bevestigde identificatie van deze bacteriële pathogenen 2-4. Deze testen profiteren van natuurlijk voorkomende faag, die specifieke en lytische zijn voor hun bacteriële gastheren. Na een nacht groei van de bacterie gekweekt in de aanwezigheid van de specifieke faag, de vorming van plaques (bacteriële lysis) biedt een positieve identificatie van de bacteriële doel. Hoewel deze tests zijn robuust, ze lijden aan drie tekortkomingen: 1) ze zijn laboratorium gebaseerd zijn, 2) ze vereisen bacteriële isolatie en kweek van het verdachte monster, en 3) zij nemen 24 tot 36 uur om te voltooien. Om deze problemen werden recombinant "light-tag" reporter faag genetisch gemanipuleerde door het integreren van de Vibrio harveyi luxAB genen in het genoom van Y. pestis en B. anthracis specifieke faag 5-8. De resulterende luxAB reporter faag waren in staat om hun specifieke doelgroep te detecteren door snel (binnen een paar minuten) en gevoelig verlenen van een bioluminescente fenotype aan ontvanger cellen. Belangrijk is dat detectie verkregen, hetzij met gekweekte cellen of de ontvanger met een mock-geïnfecteerde klinische monsters 7.
Ter demonstratie, hier beschrijven we de methode voor de faag-gemedieerde detectie van een bekende Y. pestis isoleren met behulp van een luxAB reporter faag opgebouwd uit de CDC pest diagnostische faag ΦA1122 6,7 (figuur 1). Een vergelijkbare methode, met kleine wijzigingen (bv. verandering in de groei temperatuur en media), kan worden gebruikt voor de detectie van B. anthracis isolaten, met behulp van de B. anthracis verslaggever faag Wβ:: luxAB 8. De methode beschrijft de faag-gemedieerde transductie van een biolumescent fenotype aan gecultiveerde Y. pestis cellen die vervolgens worden gemeten met behulp van een microplaat luminometer. De belangrijkste voordelen van deze methode boven de traditionele faag lysis assays is het gebruiksgemak, de snelle resultaten en de mogelijkheid om gelijktijdig te testen meerdere monsters in een 96-well microtiterplaat-formaat.
Figuur 1. Detectie schema. De faag worden gemengd met het monster, de faag infecteert de cel, luxAB worden uitgedrukt, en de cel bioluminesces. Monster verwerking is niet noodzakelijk, de faag en cellen worden gemengd en vervolgens gemeten voor licht.
Protocol
Discussion
Deze methode toont het vermogen van de verslaggever faag om snel te detecteren Y. pestis, omdat de verslaggever faag kan transduceren een lichtgevend signaal reactie op gekweekte Y. pestis cellen binnen 20 minuten na faag toevoeging. De verslaggever faag is ook in staat om direct opsporen van Y. pestis in klinische matrices, zonder de voorwaarde van de isolatie en de daaropvolgende teelt 7. Vergeleken met de standaard-faag lysis testen die vereisen over het algemeen 48 uur voor de v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de Small Business Innovation Research programma van de National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) en de USDA Nationaal Instituut voor Voedsel-en Landbouworganisatie (NIFA, 2009-33610-20028).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Difco LB agar, Miller | VWR | 90003-346 |
| Difco LB broth, Miller | VWR | 90003-350 |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific | 1485-0810 |
| n-Decanal | Sigma | D7384 |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR | 62402-984 |
Riferimenti
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. . Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , (2000).
- . . , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. . CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
