형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스
Summary
의 액체 기반 culturing 및 분배를위한 절차<em> C. 엘레간스</em형광 기자 단백질을 표현> 종자는 고가의 정렬 장비를 필요로하지 않는다는 설명이다. 이 접근법은 많은 inducible에 적용할 수 있습니다<em> C. 엘레간스</em> 오염 물질의 약물 발견을위한 유전자 또는 biosensing.
Abstract
하이 스루풋 스크리닝 (HTS)은 생물 학적 과정의 화학 변조기를 식별에 대한 강력한 접근 방식이다. 그러나, 세포 배양 모델을 사용하여 화면에서 확인된 많은 화합물은 종종 생체내 1-2에 독성이나 pharmacologically 비활성으로 볼 수 있습니다. 전체 동물 모델에서 상영하는 것은 이러한 함정을 피하는데 도움이 및 약물 개발에 대한 경로를 합리화 수 있습니다.
C. 엘레간스 잘 HTS 적합 다세포 모델 생물이다. 그것은 작은 (<1mm)과 경제적 교양과 액체에 적절하게 사용하실 수 있습니다. C.가 엘레간스 또한 약물 모드의 액션 3 신속하고 상세한 신분증을 허용 가장 실험적으로 다루기 쉬운 동물 모델 중 하나입니다.
우리는 culturing에 대한 프로토콜을 설명하고 C의 형광 변종을 분배 화학 라이브러리 또는 특정 유전자의 표현을 변경할 환경 오염 물질의 검출에 높은 처리량 검사 엘레간스. 발달 동기 웜의 큰 번호, 액체 문화에 재배 수확, 씻어, 그리고 정의 밀도에서 중단됩니다. 웜는 다음 연동 액체 디스펜서를 사용하여 검정, 평평한 바닥 384 잘 접시에 추가됩니다. 화학 라이브러리 또는 테스트 샘플 (예, 물, 음식, 또는 토양)에서 작은 분자는 벌레와 우물에 추가할 수 있습니다. 생체내에서 실시간 형광 강도가 형광 microplate 판독기로 측정됩니다. 이 방법은 C.에 inducible 유전자에 적용할 수 있습니다 적당한 기자 사용할 수있는 엘레간스. 많은 inducible의 스트레스와 발달 transcriptional 경로는 잘 C.에 정의되어 있습니다 엘레간스와 GFP 유전자 변형 기자의 종자는 이미 4 많은 존재합니다. 적절한 형질 기자와 함께하면, 우리의 방법은 경로의 모듈 레이터를위한 화면이나 환경 오염에 대한 강력한 바이오 센서 assays을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.
우리는 C를 증명 엘레간스 문화와 분배 프로토콜은 HTS 분석과 함께 우리는 C를 모니터하기 위해 개발된 엘레간스 모자 'N'칼라 전사 인자 SKN – 1. SKN – 1과 포유류의 homologue의 Nrf2 5-10 산화 스트레스와 생체 이물 중 cytoprotective 유전자를 활성화해야합니다. Nrf2는 암, neurodegeneration, 그리고 만성 염증과 같은 다양한 연령과 관련된 질환에서 포유류를 보호하고 주요 chemotherapeutic 대상 11-13되고있다. 우리의 분석은 -4 SKN – 1 대상 유전자 GST 14 GFP 유전자 변형 기자를 기반으로, 이것은 글루타티온 – S transferase 6 인코딩합니다. GST -4 기자도 SKN – 1을 활성화 및 아크릴 아미드와 메틸 수은과 같은 오염 물질의 15-16 낮은 수준을 감지하는 데 사용할 수있는 생체 이물 및 산화 화학 바이오 센서이다.
Protocol
Discussion
우리는 culturing위한 방법을 제시하고 유전자 변형 nematodes 많은 숫자를 분배. culturing 벌레에 사용되는 장비는 분자 복제를 수행 실험실을위한 표준이며, 액체 처리 및 형광 장비 microplates 많은 숫자를 처리 실험실에 대한 표준입니다. 라이브 C. 다수의 분배의 다른 방법 엘레간스 장비 19 정렬 비싼 입자가 필요합니다. Pgst – 4 : GFP 분석은 뚜껑 'N'칼라 전사 요소의 작…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. 엘레간스 transgenes은 Caenorhabditis 유전학 센터 (미네소타, 미네 아 폴리스 대학, MN)에 의해 제공되었다. 이 작품은 NIH R21 부여 KS로 NS0667678 – 01에 의해 지원되었다. 모든 저자는 수집, 분석 및 데이터 해석에 참가했습니다. CKL, KS 및 KPC는 원고를 작성하고 수정에 참여했습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy™ HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled (352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nunc | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
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