High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme
Summary
Ein Verfahren zur Flüssig-Kultivierung und die Abgabe von<em> C. elegans</em> Stämme, fluoreszierenden Reporter-Proteinen wird beschrieben, dass keine teuren Sortieranlagen. Dieser Ansatz kann auf zahlreiche induzierbaren angewendet werden<em> C. elegans</em> Gene für die Wirkstoffforschung oder Biosensorik von Schadstoffen.
Abstract
High-Throughput-Screening (HTS) ist ein leistungsstarkes Konzept zur Identifizierung von chemischen Modulatoren der biologischen Prozessen. Allerdings sind viele Verbindungen in Bildschirmen mit Zellkultur-Modellen identifiziert oft, dass sie giftig oder pharmakologisch inaktiv in vivo 1-2. Screening in ganz Tiermodelle können zur Vermeidung dieser Gefahren und optimieren den Weg zur Entwicklung von Medikamenten.
C. elegans ist ein vielzelligen Organismus-Modell auch für HTS geeignet. Es ist klein (<1 mm) und kann wirtschaftlich gezüchtet werden und abgefüllt in Flüssigkeiten. C. elegans ist auch einer der experimentell handhabbar Tiermodelle erlauben eine schnelle und detaillierte Identifizierung von Wirkstoffkandidaten mode-of-Aktion 3.
Wir beschreiben ein Protokoll für die Kultivierung und Abgabe fluoreszierender Stämme von C. elegans für das Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken oder den Nachweis von Umweltschadstoffen, dass die Expression eines bestimmten Gens zu verändern. Eine große Anzahl von entwicklungspolitisch synchronisiert Würmer sind in flüssiger Kultur angebaut, geerntet, gewaschen und aufgehängt an einer definierten Dichte. Würmer sind dann schwarz, mit flachem Boden 384-well-Platten mit einer peristaltischen Flüssigkeitsspender aufgenommen. Kleine Moleküle aus einer chemischen Bibliothek oder Proben (z. B. Wasser, Nahrung oder Boden) kann in die Vertiefungen mit Würmern hinzugefügt werden. In vivo Echtzeit-Fluoreszenz-Intensität mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader gemessen. Diese Methode kann zu jeder induzierbaren Gens in C. angepasst werden elegans, für die eine geeignete Reporter zur Verfügung steht. Viele induzierbare Stress-und Entwicklungsbiologie transkriptionelle Wege sind gut in C definiert elegans und GFP transgenen Reporter-Stämme bereits für viele von ihnen 4 existieren. Wenn mit der entsprechenden transgenen Reporter kombiniert, können unsere Methode verwendet, um für die Bahn-Modulatoren Bildschirm oder robust Biosensor-Assays für Umweltschadstoffe zu entwickeln.
Wir zeigen unseren C. elegans Kultur und Abgabe-Protokoll mit einem HTS-Assay wir entwickelt, um die C-Monitor elegans cap 'n' Kragen Transkriptionsfaktor SKN-1. SKN-1 und seine Säuger Homolog Nrf2 aktivieren zytoprotektive Gene während der oxidative Stress und xenobiotische 5-10. Nrf2 schützt Säugetiere aus zahlreichen altersbedingten Erkrankungen wie Krebs, Neurodegeneration und chronischen Entzündungen und ist zu einem wichtigen chemotherapeutischen Ziel 11-13. Unser Test auf einem GFP transgenen Reporter für die SKN-1 Zielgen gst -4 14 basiert, die kodiert für ein Glutathion-S-Transferase 6. Die gst -4 Reporter ist auch ein Biosensor für Fremdstoff-und oxidative Chemikalien, die SKN-1 zu aktivieren und können verwendet werden, um niedrige Konzentrationen von Kontaminanten wie Acrylamid und Methyl-Quecksilber 15-16 zu erkennen.
Protocol
Discussion
Wir stellen eine Methode zur Kultivierung und Abgabe einer großen Anzahl von transgenen Nematoden. Die Ausrüstung für die Kultivierung von Würmern verwendet wird Standard für Labors, die molekulare Klonierung und der Liquid-Handling-und Fluoreszenz-Ausstattung ist Standard für Labors Verarbeitung einer großen Anzahl von Mikroplatten. Andere Methoden der Abgabe eine große Anzahl von Live-C elegans teure Partikel Sortieranlagen 19. Die Pgst-4:: GFP-Assay kann zum Screening niedermoleku…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. elegans Transgene wurden von den Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN) zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde vom NIH R21 gewähren NS0667678-01 bis KS unterstützt. Alle Autoren nahmen an der Erhebung, Analyse und Interpretation der Daten. CKL, KS, und KPC nahmen schriftlich und Überarbeitung des Manuskripts.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy™ HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled (352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nunc | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
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