Denna rapport visar en teknik för mekanisk isolering av enskilda livskraftiga nervceller behålla bifogade presynaptiska boutons. Vibrodissociated nervceller har fördelarna med snabb produktion, bra farmakologisk kontroll och förbättrad rymd-clamp utan påverkan från angränsande celler. Denna metod kan användas för avbildning av synaptiska element och patch-clamp inspelning.
Mekanisk dissociation av nervceller från det centrala nervsystemet har den fördelen att presynaptiska boutons kvar på den isolerade neuron av intresse. Detta möjliggör för granskning av synaptisk transmission under förhållanden där det extracellulära och postsynaptiska intracellulära miljöer kan kontrolleras väl. En vibration-baserad teknik utan användning av proteaser, som kallas vibrodissociation, är den mest populära metoden för mekanisk isolering. En mikropipett, med spetsen brand poleras till formen av en liten boll, placeras i en hjärna skiva gjord av en P1-P21 gnagare. Den mikropipett är vibreras parallellt med slice ytan och sänkas genom slice tjocklek resulterar i befrielsen av isolerade nervceller. De isolerade nervceller är redo för studier inom ett par minuter vibrodissociation. Denna teknik har fördelar jämfört med användningen av primära neuronala kulturer, skivor hjärnan och enzymatiskt isolerade nervceller inklusive: snabb produktion av livskraftiga, relativt mogen nervceller lämplig för elektrofysiologiska och imaging studier, överlägsen kontroll av den extracellulära miljö fri från påverkan av närliggande celler, lämplighet för välkontrollerade farmakologiska experiment med snabba Drug Application och total cell superfusion samt förbättrad rymd-clamp i helcells-inspelningar i förhållande till nervceller i skiva eller cell förberedelser kultur. Detta preparat kan användas för att undersöka synaptiska fysiologi, farmakologi, moduleringen och plasticitet. Realtid avbildning av både pre-och postsynaptiska element i levande celler och boutons är också möjligt att använda vibrodissociated nervceller. Karakterisering av molekylära beståndsdelar i pre-och postsynaptiska element kan också uppnås med immunologiska och bildgivande metoder.
Framgångsrik vibrodissociation kräver att skivorna innehåller friska nervceller och interstitiell utrymmen är flexibla nog att låta nervceller att avsluta segmentet utan toxiska skador. Således fungerar tekniken optimalt vid tidig postnatal åldrar (P1-21) när friska skivor kan göras med mindre gliaceller / interstiatial material än vad som förekommer i skivor vuxna hjärnan. Vår erfarenhet är dock att optimera slice förberedelse för neuronal överlevnad i segmentet sig kan vara kontraproduktivt för vibrodissociation tekniken. Medan vi förbereder rutinmässigt skivor för in situ-inspelning med kallt modifierad aCSF som sackaros har ersatts för mycket av den extracellulära Na + och Ca 2 +, skivor beredd på vibrodissociation kan förberedas (t.ex. cut) i vår normala inspelning aCSF. När man förbereder skivor för inspelning från enskilda nervceller i skivor själva vi också skivor i normal aCSF vid 35 ° C precis efter sektionering och lämnar dem i 30-60 minuter vid denna temperatur innan tillbaka dem till rumstemperatur. Men skivor förberedda för vibrodissociation flyttade omedelbart till rumstemperatur strax efter skivning. Dessa förfaranden ger en högre avkastning av friska nervceller efter vibrodissociation, kanske på grund av bristen på fasta interstitiell vävnad som gör att nervceller att vara lättare skakas loss från segmentet själv. Vi har inte uttömmande undersökt villkoren skiva förberedelser, som vi rutinmässigt få tillräckligt med nervceller för vår inspelning och experiment avbildning på en viss dag. Det är möjligt att ytterligare ändringar, såsom ändringar i slice tjocklek eller förfaranden preincubaton kan göras för att öka avkastningen av friska nervceller. Mycket milt proteas behandlingar har prövats i ett försök att öka cellen avkastningen och få tekniken att fungera i äldre djur. Men alltid med mild proteas behandling verkar störa synaps funktion. Således, medan kombinationen proteas och mekaniska dissociation kan fortfarande hittas för att arbeta inte har visat sig vara tillförlitliga i framhjärnan nervceller hittills.
Det bör också noteras den relativt låga avkastningen av friska nervceller efter vibrodissociation innebär att tekniken är främst användbart för att studera riklig neuronala subtyper, främst projektion nervceller. Tillgången på GFP-uttryckande möss där små neuronala subpopulationer lätt kan identifieras ökar chansen att studera dessa ovanligare nervceller. Men om neuronala avkastningen kan förbättras avsevärt ansamling av uppgifter om dessa nervceller kommer sannolikt att vara ganska långsam.
Flera steg har visat sig vara avgörande för framgångsrik lastning av nervceller med kalciumavkännande färgämnen. Exponering för AM-förestrade färg utförs vid 37 ° C, och vi har tappat målet att försöka färga belastning vid lägre temperaturer. Koncentrationen av färgämnen bör optimeras med tanke på både laddningstid och temperatur eftersom det verkar som högre koncentration av färgämnet-loading sänker kalciumkoncentrationen i presynaptiska boutons. Vi har observerat att ladda med högre koncentrationer minskar frekvensen och amplituden för sIPSCs. När du laddar kalciumavkännande färgämnen i presynaptiska terminalerna vibrodissociated nervceller, måste man vara försiktig eftersom buffringskapacitet av de små presynaptiska boutons kan vara annorlunda än i soma och storlekar av boutons inte är konsekventa. Neuron som innehåller rätter tvättas med HEPES buffrad-extern lösning efter dye-lastning, och återhämtningstiden efter tvättning är avgörande. Förutom att göra en bra tätning för helcells-inspelning, måste cellerna tvättas noggrant för att bli av med icke-internaliserade färg molekyler från den yttre cellulära membran.
Förutom att använda vibrodissociated nervceller för elektrofysiologi och levande cell imaging kan immuncytokemiska metoder också tillämpas på dessa celler 11,12. Celler lätt kan fastställas och färgas med olika antikroppar, och andra markörer cellen. Användningen av dessa celler ger en ren förberedelse för visualisering av proteinuttryck i GABAergic presynaptiska terminaler. Använda möss som uttrycker fluorescerande proteiner under kontroll av initiativtagarna är specifika för GABAergic nervceller kan utredaren att identifiera enskilda synaptiska terminaler i de vibrodissociated beredningen (Figur 1). Imaging fluorescerande markörer av denna typ kan tillåta morfologiska mätningar i terminalerna med hjälp av laserbaserad mikroskopi och nyare tekniker som Plats (stimulering Emission Depletion mikroskopi). Visualisering med färgämnen som rapporterar synaptiska vesikler cykling är också möjligt med denna beredning. Akaike och medarbetare har märkt GABAergic terminaler med styryl färg, FM1-43 för att visualisera terminaler i levande celler 4.
Det bör också vara möjligt att utföra encelliga reverse transkriptas PCR att profilera RNA-uttryck i vibrodissociatednervceller. Denna teknik är rutinmässigt tillämpas enzymatiskt-differentierade nervceller och nervceller som odlas i cellkultur.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka för Dr. Ping juni Zhu och Susumu Koyama för deras stöd under den inledande uppbyggnaden av tekniken, och Dr Veronica Alvarez om hjälp med att formatera skrivet manus. Denna studie har finansierats av avdelningen för Interna klinisk och biomedicinsk forskning av NIAAA.
Item | Company | Catalog# | Comments |
Vibrating Tissue Slicer | Leica Microsystems Inc. | VT1200S | |
Cell Culture Dish (35 mm) | BD Falcon | 353001 | |
Glass Bottom Dishes | Willco-dish | GWSB-5040 Or GWSB-3522 | 0.16-0.19 mm glass thickness for imaging |
Piezoelectric Manipulator | Exfo-Burleigh | LSS-3000 | Could also use relay, etc. |
SD9 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | SD9K | For triggering piezoelectric manipulator |
Dissecting Stereoscope | Wild Heerbrugg | TYP 374590 | Could also use any stereoscope |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW-150F-4 | For flame-sealed glass micropipette and patch micropipette |
Six Channel Perfusion Valve Control Systems | Warner Instruments | VC-6 or VC-6M | |
Perfusion Fast-Step | Warner Instruments | SF-77B | |
Inverted Microscope with 20-63x objectives | Nikon | TS200 Diaphot | |
EMCCD Camera | ANDOR Technology | iXonEM+ DU-888 | |
Excite Fluorescence Illumination Light Source | EXFO Photonics Solutions Inc. | X-Cite 120PC | |
Fluo-4, AM calcium indicator | Molecular Probes | F14201 |