Un protocollo minimamente invasiva per stabilizzare la colonna vertebrale del mouse ed eseguire ripetitivo In vivo spinale utilizzando la microscopia a due fotoni è descritto. Questo metodo combina un dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e un regime di anestetico per ridurre al minimo i movimenti respiratori indotti e produrre dati di immagini grezzi che non richiedono l'allineamento o altre post-elaborazione.
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Articolo metodologico
Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Imaging in vivo mediante microscopia a due fotoni 1 nei topi che sono stati geneticamente modificati per esprimere proteine fluorescenti in specifici tipi cellulari 03/02 ha notevolmente ampliato la nostra conoscenza dei processi fisiologici e patologici in numerosi tessuti in vivo 4-7. Negli studi del sistema nervoso centrale (SNC), c'è stata una vasta applicazione di imaging in vivo del cervello, che ha prodotto una pletora di nuove e spesso inattese scoperte sul comportamento delle cellule come i neuroni, astrociti, microglia, in condizioni fisiologiche o patologiche 8-17. Tuttavia, le complicanze per lo più tecnici hanno limitato l'attuazione di imaging in vivo negli studi del midollo spinale del mouse vivente. In particolare, la vicinanza anatomica del midollo spinale ai polmoni e al cuore genera artefatti significativo movimento che rende l'imaging del midollo spinale che vivono un compito impegnativo. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo che supera i limiti intrinseci di imaging del midollo spinale mediante la stabilizzazione della colonna vertebrale, la riduzione delle vie respiratorie indotta da movimenti e facilitando così l'utilizzo della microscopia a due fotoni per l'immagine del midollo spinale del mouse in vivo. Questo si ottiene combinando un dispositivo personalizzato di stabilizzazione vertebrale con un metodo di anestesia profonda, con una conseguente significativa riduzione delle vie respiratorie indotta movimenti. Questo protocollo video mostra come esporre una piccola zona del midollo spinale vivente che può essere mantenuto in condizioni fisiologiche stabili per lunghi periodi di tempo, mantenendo danno tissutale e sanguinamento al minimo. Rappresentante immagini RAW acquisite in dettaglio vivo in alta risoluzione la stretta relazione tra microglia e la vascolarizzazione. Una sequenza timelapse mostra il comportamento dinamico dei processi microgliali nel midollo spinale del mouse vivente. Inoltre, una scansione continua della stessa z-frame dimostrares la stabilità eccezionale che questo metodo può raggiungere per generare pile di immagini e / o filmati timelapse che non richiedono l'allineamento dell'immagine post-acquisizione. Infine, ci mostrano come questo metodo può essere usato per rivisitare e re-imaging stessa area del midollo spinale in seguito timepoints, consentendo studi longitudinali in corso di processi fisiologici o patologici in vivo.
Protocollo
1. Costruire il dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale
- Ordina la STS-A Narishige Morsetti Compact midollo spinale e la MA-6N Narishige adattatore in mano la testa.
- Design personalizzato e fare una piastra di base in acciaio inox per tenere le due parti Narishige in allineamento in modo che la testa dell'animale è supportato mentre la sua spina dorsale e la coda sono bloccato. Tenete presente che l'intero dispositivo dovrebbe andare bene sotto la lente microscopio di solito su un palco microscopio abbassato.
2. Animal chirurgia
- Pre-riscaldare la camera di microscopio con un dispositivo....
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Discussione
Il metodo qui descritto consente di stabile e ripetitivo nel imaging in vivo di densamente popolate strutture fluorescenti cellulari nel midollo spinale di topi anestetizzati utilizzando la microscopia a due fotoni. La stabilità raggiunta è il risultato di un dispositivo su misura di stabilizzazione della colonna vertebrale e un regime di anestetico che riduce respiratoria indotta artefatto movimento. Il dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale permette di respiro sotto il corpo del mous.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Multiple Sclerosis Society concedere RG4595A1 / T per DD e il NIH / NINDS concede NS051470, NS052189 e NS066361 alle figure KA e film adattato e / o ristampati da Davalos et al., J Metodi Neurosci. Mar 2008 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, con il permesso di Elsevier.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Rodamina B destrano | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluito in ACSF (3% w / v) |
| Ketamina HCl | Bionichepharma | NDC No: 67457-001-10 | Iniettabili, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd Labs | NADA No: 139-236 | Xylazina iniettabili, 20mg/ml |
| Acepromazina | Vedco | NADA No: 117-531 | Iniettabili, 10mg/ml |
| Lacrime artificiali unguento | Fenice farmaceutico | NDC No: 57319-760 - 25 | Lubrificante |
| Betadine | Pescatore | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Forbici | Mondo di precisione Strumenti | 555500S | Curvato, smussato-tip forbici |
| Pinza dritta | Mondo di precisione Strumenti | 555047FT | Pinza punta dentata |
| Cauterizzare piccoli vasi | Strumenti Scienza multa | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia, Pfizer Inc. | Mixer Mill MM400 | |
| Compatta del midollo spinale morsetti | Narishige | STS-A | |
| Adattatore tenendo testa | Narishige | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham Biosciences Corp. | 80-6421-43 | |
| Ringer lattato | Baxter Healthcare | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC No: 12496 - 6757-1 | Buprenorfina, iniettabili |
| Baytril | Bayer | NADA 140-913 | Enrofloxacina, iniettabili antibatterico 2,27% (20ml) |
| Riscaldamento pad - Grande | Strumenti Scienza multa | 21060-10 |
Riferimenti
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G.
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Ristampe e permessi
