Vi beskriver här en metod för biopsying olfactory slemhinna från råttor och människor näshålan. Dessa biopsier kan användas antingen för att identifiera molekylära avvikelser i hjärnans sjukdomar eller isolera multipotenta adulta stamceller, som kan utnyttjas för celltransplantation i djurmodeller av hjärnan trauma / sjukdom.
Den lukt slemhinnor, som ligger i näshålan, är ansvarig för att upptäcka lukter. Det är också den enda nervvävnad som utsätts för den yttre miljön och lättillgängliga i varje levande individ. Som ett resultat, är denna vävnad unikt för någon syfte att identifiera molekylära avvikelser i patologiska hjärnan eller isolera adulta stamceller för cellterapi.
Molekylära avvikelser i hjärnans sjukdomar är ofta studeras med hjälp av nervvävnad prover som tagits efter slakt. Emellertid har detta material antal begränsningar. Däremot är det luktsinnet slemhinnan lättillgänglig och kan man ta biopsier ifrån säkert utan någon förlust av luktsinnet 1. Därför ger luktsinnet slemhinnan ett "öppet fönster" i den vuxna människans genom vilken man kan studera utveckling (t.ex. autism, schizofreni) 2-4 eller neurodegenerativa (t.ex. Parkinson, Alzheimer) sjukdomar 4,5. Olfactory slemhinna kan användas för antingen jämförande molekylära studier 4,6 eller in vitro-försök på neurogenes 3,7.
Den luktepitel är också en nervvävnad som producerar nya nervceller varje dag för att ersätta dem som skadas av föroreningar, bakterier av virusinfektioner. Denna ständiga neurogenes upprätthålls av stamceller, men också stamceller som är bosatta inom både fack i slemhinnan, nämligen neuroepithelium och den underliggande lamina propria 8-10. Vi nyligen utvecklat en metod för att rena den vuxna stamceller som finns i lamina propria och efter att ha visat att de är närstående till benmärgen mesenkymala stamceller (BM-MSC), heter vi dem lukt Ecto-mesenkymala stamceller (OE- MSC) 11.
Intressant, jämfört med BM-MSC, OE-MSC visa en hög spridning takt, en förhöjd clonogenicity och en benägenhet att differentieras till neurala celler. Vi drog fördel av dessa egenskaper för att utföra studier tillägnad avtäcka nya gener vid schizofreni och Parkinsons sjukdom 4. Vi och andra har också visat att OE-MSC är lovande kandidater för cellterapi, efter en ryggmärgen trauma 12,13, ett cochlea skada 14 eller i en djurmodeller av Parkinsons sjukdom 15 eller minnesförlust 16.
I denna studie presenterar vi metoder för att biopsi lukt slemhinna hos råtta och människa. Efter samlingen är lamina propria enzymatiskt separeras från epitel och stamceller renas med hjälp av en enzymatisk eller en icke-enzymatisk metod. Renat lukt stamceller kan sedan antingen odlas i stora antal och bankas i flytande kväve eller förmås att bilda sfärer eller differentieras till neurala celler. Dessa stamceller kan också användas för jämförande omik (genomisk, transcriptomic, epigenomiska, proteomik) studier.
De tekniker som presenteras här gör gnagare och mänskliga luktsinnet slemhinna en användbar modell för klinisk forskning kring orsakerna till nervsystemets utveckling och neurodegenerativa sjukdomar samt ett verktyg för att reparera patologiska eller traumatiserade hjärna. Protokollet är relativt enkelt och kan lätt utföras av en erfaren cellbiolog. Den relativa framgången av biopsin och kultur tekniker är höga.
Kritiska steg
Möjliga ändringar
Framtida tillämpningar
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds ekonomiskt av ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les myopatier), Europeiska regionala utvecklingsfonden i PACA och Irme (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l'Encéphale). Vi tackar tacksamt Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Institute) för hennes effektiv hjälp under tiden förfaller inspelning.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Collection of olfactory mucosa in rats | ||
DMEM/HAM F12 | Invitrogen | 31331-028 |
Sodium Pentobarbital | ||
Rongeur | FST | |
26 gauge needle | Terumo | NN-2613R |
Forceps | ||
Collection of olfactory mucosa in humans | ||
Rigid endoscope | Karl Storz or Richard Wolf Medical | |
Lidocaine | ||
Epinephrine | ||
Throughcut ethmoid forceps | Karl Storz or Richard Wolf Medical | |
Isolation of olfactory stem cells | ||
Dispase II | Roche | 10 295 825 001 |
Dissecting microscope | ||
Micro spatula | FST | |
Collagenase IA | Sigma-Aldrich | C9891 |
Ca-free/Mg-free PBS | Invitrogen | 14190-250 |
Fetal calf serum | Invitrogen | 10270098 |
Glass coverslip | Knittel Glaser | 001/35 |
Sphere formation and neuronal differentiation | ||
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P-1274 |
Insulin transferrin selenium (ITS) | Invitrogen | 51500056 |
EGF | R&D Systems | 236-EG |
FGF2 | R&D Systems | 233-FB |
Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 |
B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 |
Glutamine | Invitrogen | 25030024 |
Glutamate | Sigma-Aldrich |