Embriões pré-implantação pode ser criopreservados após a colocação em uma solução hipertônica crioprotectores para causar desidratação celular. Após atingir o equilíbrio, a formação de cristais de gelo é induzida na solução em torno do embrião. Maior desidratação ocorre quando o embrião é lentamente resfriado a temperaturas abaixo de zero antes de mergulhar em nitrogênio líquido para o armazenamento.
Pré-implantação de embriões de bovinos, ovinos e caprinos podem ser criopreservados para armazenamento de curto ou longo prazo. Embriões pré-implantação é predominantemente constituído por água, e evitar a formação intracelular de cristais de gelo durante o processo de criopreservação é de suma importância para manter a viabilidade do embrião. Embriões são colocados em uma solução hipertônica (1,4-1,5 M) de um agente de crioprotetores (CPA), tais como etileno glicol (EG) ou glicerol (Glyc) para criar um gradiente osmótico que facilita a desidratação celular. Após atingir o equilíbrio osmótico de embriões na solução CPA, são individualmente carregados na solução hipertônica CPA em 0,25 ml canudos de plástico para congelar. Embriões são colocados em um freezer taxa controlada a uma temperatura de -6 ° C. Formação de cristais de gelo é induzida na solução CPA em torno do embrião, e cristalização provoca um aumento na concentração de CPA fora do embrião, causando desidratação celular ainda mais. Embriões são resfriados a uma taxa de 0,5 ° C / min, permitindo uma maior desidratação, a uma temperatura de -34 ° C antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido (-196 ° C). Embriões criopreservados devem ser descongelados antes da transferência para um destinatário (substituto) do sexo feminino. Palhas contendo os embriões são removidos do nitrogênio líquido dewar, realizado em ar ambiente de temperatura de 3 a 5 seg, e colocados em banho-maria a 37 ° C por 25 a 30 seg. Embriões criopreservados em Glyc são colocados em uma solução de sacarose 1 M por 10 min para a remoção do CPA antes da transferência para um destinatário (substituto) do sexo feminino. Embriões criopreservados em EG, no entanto, podem ser diretamente transferidos para o útero de um destinatário.
Porque os embriões é predominantemente constituído por água, é crucial que os embriões pré-implantação ser adequadamente desidratadas e lentamente resfriado, de acordo com o protocolo descrito aqui para evitar a formação de cristais de gelo intracelular. Uma vez que o processo de resfriamento começou, é importante para manter a mudança de temperatura e unidirecional para evitar flutuações de temperatura. Início da formação de cristais de gelo ("semeadura") a uma temperatura adequada para a solução CPA específicos é fundamental.
Modificações a este resfriamento lento / Método de descongelamento rápido para criopreservação de embriões pré-implantação incluir o método de uma etapa (onde a última coluna do meio carregado na palha é a sacarose, em vez de solução CPA) 19 eo método de transferência direta (onde os embriões congelados em etileno glicol são descongelados e transferidos diretamente para o útero de uma fêmea destinatário sem antes remover o etileno glicol a partir do embrião) 20. Para reduzir o volume de etileno glicol depositados no útero de uma transferência direta (DT) do sexo feminino destinatário, é aconselhável para preencher a palha de 0,25 ml com 6 cm segurando médio antes de continuar como descrito anteriormente. Note-se que existe um padrão voluntário no setor comercial de transferência de embrião pré-implantação de embriões criopreservados que para DT devem ser congeladas em amarelo cor de palha e armazenados em amarelo cor de taças no nitrogênio líquido dewar. O setor comercial também tem exigências específicas de rotulagem para todos os embriões criopreservados que devem ser seguidas.
Uma alternativa para esse método é vitrificação 21, um método de não equilíbrio de criopreservação onde uma mais concentrada (6-8 M) solução CPA é resfriado ultra-rapidamente causando a solução CPA para mudar do estado líquido para um estado "vidrados" sem gelo cristal formação. Vitrificação é provável mais adequado para a criopreservação de embriões que são menos avançados do que developmentally mórula compacta devido à sua sensibilidade à temperatura aumentada.
Esta técnica tem aplicação para a preservação de germoplasma de recursos exclusivos 22, bem como para a indústria de transferência de embrião comerciais internacionais, onde mais de 55% dos cerca de 500.000 embriões pré-implantação bovina transferidos no ano civil de 2008 foram criopreservados. 23
The authors have nothing to disclose.
Financiamento parcial do projeto de pesquisa USDA multi-estado W-2171 "Células Germinativas e Desenvolvimento e manipulação dos embriões para a Melhoria da Pecuária" é reconhecido agradecimento. Os talentos artísticos de Ryan Callahan, que preparou as ilustrações técnicas para a parte de vídeo do presente artigo, são também reconhecido agradecimento.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
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BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
ViGro thaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
SYNGRO Holding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco’s phosphate buffered saline |
BioLife BSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
BioLife antibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
BioLife trypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
Name of the equipment | Company | Catalog number | Comments (optional) |
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Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |