세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜
Summary
우리는 세포 성숙을 유발하지 않고 플라스미드 DNA 나 siRNA 중과 기본 인간 단핵구 파생 돌기 세포를 transfecting의 효율적인 방법으로서 최적화된 높은 처리량 nucleofection 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 타겟 유전자 mRNA와 단백질 수준 모두에서 릭 – 전의 성공적인 siRNA의 입을 대한 증거를 제공합니다.
Abstract
돌기 세포 (DCS)은 자사의 개시 및 감염 1 반응에서 중요한 역할을 면역 시스템의 센티넬 간주될 수 있습니다. 나이브 DC가에 의해 병원성 항원의 검색은 병원체 – 관련 분자 패턴 (PAMPS)로 불리는 특정 보존 구조를 인식할 수있는 패턴 인식 수용체 (PRRs)를 통해이다. DC가로 PAMPs가 탐지 성숙 DC가 자신의 활성화 및 변화의 결과로 세포내 신호 폭포를 트리거합니다. 이 과정은 일반적으로 다른 전염증성 크린 시토킨와 함께 제 1 형 인터페론의 생산이 특징입니다, 이러한 T 세포와 상호 작용이 적응 면역 반응 2을 시작 배수 림프절에 성숙한 DC의 MHCII와 CD86 및 마이 그 레이션과 같은 세포 표면 마커의 upregulation, 3. 따라서 DC가 그 본래 및 적응 면역 시스템을 연결합니다.
각종 병원균에 DC 응답을 기본 분자 네트워크를 해부하다하는 능력은 이러한 신호 경로의 규제 및 유도 유전자를보다 잘 이해하는 데있어 매우 중요합니다. 또한 전염병 및 종양에 대한 DC – 기반 백신의 개발을 용이하게 도움이 될 것입니다. 그러나, 연구의이 라인은 심각하게 기본 DC가 4 transfecting의 어려움으로 장애가되었습니다.
같은 lentiviral 시스템으로 바이러스 전달 방식은, 일반적으로 사용하지만, 이러한 복잡 성과 바이오 유해 위험 (관련 비용) 5,6,7,8 많은 한계를 가지고있다. 또한, 바이러스성 유전자 제품의 배달 DC가 9,10,11,12을 transduced 사람의 immunogenicity을 증가시킵니다. Electroporation은 혼합 결과 13,14,15와 함께 사용하지만, 우리는 높은 처리량 transfection 프로토콜의 사용을보고하고 결론의 유틸리티를 입증하는 최초되었습니다.
이 보고서에서 우리는 제한된 세포 독성 및 DC 성숙 16 부재와 함께, 인간의 기본 DC가의 높은 처리량 transfection을 위해 최적화된 상용 프로토콜을 요약합니다. Transfection 효율 (GFP 플라스미드의)와 세포 생존 능력은 각각 50 % 이상 70 % 였어요. qRT – PCR은 IFNβ 전혀 upregulation을 증명하지 동안 외과 분석, transfected 세포의 성숙 마커 CD86와 MHCII 표현 증가의 부재를 설립하였습니다. 이 electroporation 프로토콜을 사용하여, 우리는 siRNA와 효과적인 타겟 유전자의 허물고와 DC가 성공적으로 transfection에 대한 증거를 제공하는 장비 – I, mRNA와 단백질 수준 모두에서 핵심적인 바이러스성 인식 수용체 16,17.
Protocol
Discussion
나이브 기본 돌기 세포의 transfection 효율이 높은 처리량 분석 및 본래 – 적응 면역 전환을 중재이 핵심 세포 세포 염증 경로의 리버스 엔지니어링을 위해 중요합니다. 그러나, 대부분의 조사는 이러한 세포가 표준 transfection 기술을 사용하는 경우 모두 효율적으로 transfection 절차 유도 세포 성숙하지 않고 transfect하기 어려운다는 것을 찾을 수 있습니다. 우리는 이러한 제한이 동시에 독립 96 – 웰 상?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 NIH NIAID 계약 번호 HHSN2662000500021C에 의해 지원되었다. 우리는 그의 기술 지원 밍 첸 감사합니다.
Materials
| Equipment/Reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
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