Vi presentiamo il nostro sito ottimizzato high-throughput protocollo nucleofection come un modo efficace di trasfezione delle cellule dendritiche umane primarie derivate da monociti sia con DNA plasmidico o siRNA senza provocare la maturazione delle cellule. Abbiamo inoltre fornire le prove per il silenziamento del gene siRNA successo mirati RIG-I, sia a livelli di mRNA e proteine.
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Articolo metodologico
Protocollo ottimizzato per Transfection efficiente delle cellule dendritiche, senza la maturazione delle cellule
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule dendritiche (DC) può essere considerato sentinelle del sistema immunitario che svolgono un ruolo critico nella sua iniziazione e la risposta alle infezioni 1. Rilevazione dell'antigene patogeni da DC ingenuo è attraverso i recettori pattern recognition (PRR) che sono in grado di riconoscere specifiche strutture conservate denominate modelli molecolari patogeni associati (PAMPs). Rilevazione di PAMPs da DC innesca una cascata di segnalazione intracellulare con conseguente loro attivazione e la trasformazione di DC mature. Questo processo è tipicamente caratterizzata da produzione di interferone di tipo 1 insieme ad altre citochine proinfiammatorie, sovraregolazione di marcatori cellulari di superficie come MHCII e CD86 e la migrazione delle DC mature ai linfonodi drenanti, dove l'interazione con le cellule T avvia la risposta immunitaria adattativa 2, 3. Così, DC collegare i sistemi immunitario innato e adattativo.
La capacità di sezionare le reti molecolari alla base della risposta DC a vari agenti patogeni è fondamentale per una migliore comprensione del regolamento di queste vie di segnalazione e le loro geni indotti. Dovrebbe anche contribuire a facilitare lo sviluppo di DC-based vaccini contro le malattie infettive e tumori. Tuttavia, questa linea di ricerca è stato gravemente ostacolato dalla difficoltà di trasfezione primario DC 4.
Metodi di trasduzione del virus, come il sistema lentivirale, sono tipicamente utilizzati, ma portano molti limiti come la complessità e bio-pericolosi rischio (con i costi associati) 5,6,7,8. Inoltre, la consegna dei prodotti gene virale aumenta l'immunogenicità di coloro trasdotte DC 9,10,11,12. Elettroporazione è stata utilizzata con risultati alterni 13,14,15, ma siamo i primi a segnalare l'utilizzo di un high-throughput protocollo di trasfezione e definitivamente dimostrare la sua utilità.
In questa relazione si riassumono un protocollo ottimizzato commerciale high-throughput per la transfezione di DC umane primarie, con limitata tossicità delle cellule e l'assenza di maturazione DC 16. L'efficienza di trasfezione (di plasmide GFP) e la vitalità delle cellule erano più del 50% e 70% rispettivamente. FACS analisi stabilito l'assenza di aumento di espressione della maturazione e MHCII marker CD86 in cellule trasfettate, mentre qRT-PCR ha dimostrato di non sovraregolazione IFNβ. Usando questo protocollo di elettroporazione, forniamo le prove per la trasfezione di successo di DC con siRNA ed efficace di abbattere genica mirata RIG-I, un recettore chiave riconoscimento virale 16,17, sia a livelli di mRNA e proteine.
Protocollo
1. Programmare il Amaxa 96 pozzetti navetta Nucleofector
- Aprire un nuovo file di parametri.
- Selezionare il numero di pozzi che verrà utilizzato per la trasfezione di serie trascinando il cursore sul diagramma 96 pozzetti. Usare un minimo di 3 pozzi di piscina per ogni campione sperimentale.
- Inserire il codice del programma: in part1 selezionare 'FF' e in part2 selezionare '168 'dal menu a discesa
- Dalla soluzione casella di selezione 'Monocita, umano'
- Secondo l'opzione di controllo, selezionare 'standard'.
- Fare clic su Applica.
- Per includere una no-transfezione di controllo, selezionare ulteriori p....
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Discussione
Trasfezione efficiente ingenuo cellule dendritiche primario è importante per l'analisi di un elevato throughput e reverse engineering di cellulari vie infiammatorie in questa cellula fondamentale della mediazione innata-adaptive transizione del sistema immunitario. Tuttavia, la maggior investigatori scoprire che queste cellule sono di difficile trasfezione in modo efficiente e senza la maturazione di transfezione delle cellule procedura di induzione quando si utilizzano tecniche di trasfezione standard. Abbiamo stud.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il progetto è stato sostenuto da NIH Contratto NIAID No. HHSN2662000500021C. Ringraziamo Ming Chen per la sua assistenza tecnica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Attrezzature / Reagente | Azienda | Catalogo # | Commenti |
| Amaxa Nucleofector 96-ben Shuttle | Lonza | 108S0109 | Numero di serie |
| Amaxa monociti umani a 96 pozzetti Kit Nucleofector | Lonza | VHPA-2007 | Contiene i monociti umani a 96 pozzetti Soluzione Nucleofector, il supplemento a 96 pozzetti e la Nucleocuvettes e piastre |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplementato con 10% FCS, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml di streptomicina per rendere terreno di crescita continua |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutammina | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillina / streptomicina | Invitrogen | 15070063 | |
| Siero di vitello fetale | Hyclone | 3.070,03 | |
| Le cellule dendritiche | New York Sangue centro | DC sono purificati da buffy coats utilizzando una procedura standard |
Riferimenti
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J.
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Ristampe e permessi
