פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

Summary

שיטה פשוטה אך מדויקת לאסוף כתם hemocytes יתוש מתואר. השיטה שלנו משלבת את הפשטות של זלוף עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד את ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים. שיטה זו מקלה על מחקרים וידע המחייב של סוגי hemocytes ושפע שלהם.

Abstract

יתושים הם וקטורים עבור מספר גורמי מחלות ומזיקים כגון וירוס קדחת צהובה, טפילי מלריה ותולעים filarial. מעבדות חוקרת אנטי הפתוגן מרכיבים של מערכת החיסון המולדת של וקטור מחלת מין בתקווה ליצור יתושים מהונדס, כי הם מגיבים פתוגנים כגון ^{1, 2.} מערכת החיסון המולדת של יתושים כולל כמה שורות של הגנה ^3. פתוגנים שמצליחים לברוח המכשול שהוטלו על ידי יתוש אפיתל מצופה midgut ⁴ להיכנס hemolymph והמפגש hemocytes במחזור, מרכיבים תאיים חשובים לתמצת פתוגנים לבלוע ^{5, 6.} החוקרים לא מצאו ראיות רקמות hematopoietic ב יתושים ראיות הנוכחי עולה כי מספר hemocytes קבוע על הופעתה מבוגרים המספרים בפועל עשוי לרדת כפי הגילאים יתושים ^7. היכולת לזהות כראוי לאסוף hemocytes מפני חרקים חשוב מבחינה רפואית היא צעד חיוני ללימודי חסינות הסלולר. עם זאת, גודלו הקטן של יתושים נפח מוגבל של hemolymph מהווים אתגר לאיסוף תאים חיסוניים.

שתי שיטות לאיסוף הוקמה hemocytes יתושים כולל גירוש hemolymph מתוך חוטם לחתוך ^8, ועקירה נפח (זלוף), שבו מלוחים מוזרק באזור necklike קרומי בין הראש לבין החזה (כלומר, צוואר הרחם) לבין hemolymph perfused נאסף מפתיחת קרוע באזור הדיסטלי של הבטן ^{9, 10.} טכניקות אלו, לעומת זאת, מוגבלים על ידי התאוששות נמוכה של hemocytes וזיהום אפשרי על ידי תאים שומן בגוף, בהתאמה ^11. לאחרונה שיטה המכונה התאוששות הזרקה / התאוששות גבוהה משופרת של immunocytes על ידי שימוש מאגרים קרישה תוך הפחתת רמות זיהום קשקשים ורקמות פנימיות ^11. אמנם שיטה המאפשרת שיטה משופרת של איסוף ושמירה hemocytes לתרבות העיקרי, הוא טומן בחובו מספר שלבים הזרקה איסוף שאינם נחוצים אם המטרה היא לאסוף את הזרם, לתקן כתם hemocytes עבור אבחון. הנה, אנחנו מדגימים את השיטה שלנו של איסוף hemolymph יתוש המשלבת את הפשטות של זלוף, באמצעות מאגרים קרישה במקום תמיסת מלח, עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים.

Protocol

1. Preparation in advance of hemocyte collection Prepare a hemolymph diluent solution that consists of 60% Schneider’s Medium, 10% fetal bovine serum (FBS), and 30% citrate buffer (anticoagulant; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 41 mM citric acid, pH 4.5) 11. Make 1.0 mL aliquots that can be stored at -20°C. Use each aliquot only once (see Materials). Prepare glass microscope slides (75 x 25 x 1 mm) by scoring a 1 cm diameter circle at one end using a glass-etching tool. …

Discussion

שיטת איסוף hemocyte המתואר כאן הוא שונה משיטות שפורסמו בעבר ומאפשר לבודד את ההכנות נקי של hemocytes מ Aedes יתושים בצעדים פחות. בעוד עניין מיוחד שלנו טמון באפיון האוכלוסיות hemocyte ב Aedes יתושים, אנו מאמינים כי הטכניקה הזו יכול להיות מיושם על קבוצות אחרות יתוש לאחר הניסויי…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Schneider’s Medium	Sigma-Aldrich	S0146
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F0643
Hema3 stain kit	Fisher	123-869
Glass needles (borosilicate with filament)	Sutter Instrument	BF100-78-10	1.0mm O.D. and 0.78mm I.D.
Needle puller	Sutter Instruments	Model P-87
MicroInjector	Tritech Research	MINJ-PD
Needle holder	Tritech Research	MINJ-4