Un protocollo per la raccolta e la colorazione ematociti concentrati dal Mosquito febbre gialla Aedes aegypti</em

Sommario

Un semplice ma accurato metodo per raccogliere e macchia ematociti concentrati zanzara è descritto. Il nostro metodo combina la semplicità di perfusione con la precisione delle tecniche di iniezione ad alta isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati in Aedes zanzare. Questo metodo facilita la conoscenza di studi che richiedono i tipi di ematociti concentrati e la loro abbondanza.

Abstract

Le zanzare sono vettori di una serie di agenti patogeni che causano malattie come il virus della febbre gialla, malaria, parassiti e vermi filarial. Laboratori stanno studiando anti-patogeno componenti del sistema immunitario innato nella specie dei vettori di malattie, nella speranza di generare zanzare transgeniche che sono refrattari agli agenti patogeni quali ^{1, 2.} Il sistema immunitario innato di zanzare è composto da diverse linee di difesa ^3. Agenti patogeni che riescono a sfuggire alla barriera imposta dalla epitelio-allineata zanzara midgut ^{4 Inserire} il emolinfa e di incontro ematociti concentrati in circolazione, importanti componenti cellulari che incapsulano e patogeni fagocitare ^{5, 6.} I ricercatori non hanno trovato prove per i tessuti emopoietici in zanzare e fatti suggeriscono che il numero di ematociti concentrati è fissato a emergere per adulti e numeri può effettivamente diminuire con l'invecchiamento della zanzara ^7. La capacità di raccogliere correttamente e identificare ematociti concentrati dagli insetti medicalmente importante è un passo essenziale per gli studi di immunità cellulare. Tuttavia, la dimensione piccola delle zanzare e il volume limitato di emolinfa rappresentano una sfida a raccogliere le cellule immunitarie.

Due metodi per la raccolta di ematociti concentrati zanzara comprendono espulsione di emolinfa da un taglio proboscide ^8, e lo spostamento del volume (perfusione), in cui viene iniettato soluzione salina nella regione membranosa necklike tra la testa e torace (cioè, cervice) e la perfusione emolinfa viene raccolta da un'apertura strappato in una regione distale dell'addome ^{9, 10.} Queste tecniche, tuttavia, sono limitate da basso recupero di ematociti concentrati e di possibile contaminazione da parte delle cellule di grasso corporeo, rispettivamente ^11. Più recentemente un metodo denominato di iniezione ad alta / recupero di un migliore recupero immunocytes mediante l'uso di tamponi anticoagulanti, riducendo i livelli di contaminanti scale e tessuti interni ^11. Anche se questo metodo permette un metodo migliorato di raccolta e di conservazione ematociti concentrati per la cultura primaria, che comporta un certo numero di iniezione e fasi di raccolta che non sono necessari se l'obiettivo a valle è quello di raccogliere, fissare e macchia ematociti concentrati per la diagnostica. Qui, dimostriamo il nostro metodo di raccolta emolinfa zanzara che unisce la semplicità di perfusione, utilizzando tamponi anticoagulante al posto della soluzione fisiologica, con la precisione delle tecniche di iniezione ad alta isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati in Aedes zanzare.

Protocollo

1. Preparazione in anticipo della raccolta hemocyte

1. Preparare una soluzione diluente emolinfa che consiste di 60% di media Schneider, 10% di siero fetale bovino (FBS) e tampone citrato 30% (anticoagulante; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 ml Acido citrico, pH 4,5) ^11. Fai aliquote 1,0 ml che possono essere conservati a -20 ° C. Utilizzare ciascuna aliquota solo una volta (vedi Materiali).
2. Preparare vetrini da microscopio in vetro (75 x 25 x 1 mm) segnando un 1 cm di diametro cerchio ad una estremità con un vetro incisione strumento. In alternativa, vetrini da microscopio con due pre-inciso circoli possono essere acquistati (ad ....

Discussione

Il metodo di raccolta hemocyte qui descritto è stato modificato dai metodi precedentemente pubblicato e permette di isolare i preparativi pulita di ematociti concentrati da zanzare Aedes con meno passaggi. Mentre il nostro particolare interesse risiede nel caratterizzare popolazioni hemocyte in zanzare Aedes, crediamo che questa tecnica può essere applicata a gruppi di altre zanzare, dopo gli studi iniziali condotti per determinare il volume d'iniezione appropriate. Il nostro protocollo utilizza bu.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Media Schneider	Sigma-Aldrich	S0146
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F0643
Hema3 kit macchia	Pescatore	123-869
Vetro aghi (Borosilicato con filamento)	Sutter strumento	BF100-78-10	1,0 millimetri OD e 0,78 millimetri ID
Ago estrattore	Sutter Instruments	Modello P-87
MicroInjector	Tritech di ricerca	Minj-PD
Porta aghi	Tritech di ricerca	Minj-4