وقد أجري تحليل لتحديد ميكروأري ملامح التعبير الجيني في<em> C. ايليجانس</em> ، وكان يستخدم في الوقت الحقيقي PCR للتحقق من صحة البيانات وتحديد ميكروأري.
وتتكون من نقاط الاشتباك العصبي قبل المشبكي منطقة نشطة في الخلية إشارات ومحطة بعد المشبكي في الخلية المستهدفة. في حالة المشابك الكيميائية ، وتنفذ على رسائل كتبها العصبية أطلق سراحهم من قبل المشبكي والمحطات التي تلقتها المستقبلات على الخلايا بعد المشبكي. وقد أظهرت أبحاثنا السابقة في ايليجانس انواع معينة أن VSM – 1 ينظم سلبا إيماس. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر تحليل نقاط الاشتباك العصبي في المسوخ 1 – VSM أن الحيوانات التي تفتقر إلى وظيفية بالكامل اتصال متشابك VSM – 1 قد زادت. بناء على هذه النتائج الأولية ، ونحن افترضنا أن جيم قد ايليجانس VSM – 1 تلعب دورا حاسما في synaptogenesis. لاختبار هذه الفرضية ، تم إجراء تحليل المزدوج المسمى ميكروأري ، وتحددت ملامح التعبير الجيني. أولا ، تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع كتب reversely ل[كدنا] ، وتهجين للميكروأرس الحمض النووي. ثم ، كشف في والسيليكو تحليل التهجين التحقيق الفلورسنت تحريض كبير من العديد من الجينات الترميز لأفراد من عائلة الحيوانات المنوية البروتين الرئيسية (حركة مجتمع السلم) في المسوخ مع synaptogenesis المحسنة. المشروعات المتوسطة الحجم هي مكون رئيسي من الحيوانات المنوية في C. ايليجانس ويبدو أن الإشارة نضوج البويضة والديدان الخيطية الإباضة. في ذباب الفاكهة ، تظاهر تشاي وزملاؤه MSP (1) التي تشبه جزيئات قبل المشبكي تنظيم عدد وحجم حبة عند تقاطع العصبية والعضلية. وعلاوة على ذلك ، اقترح تحليل أجراه تسودا وزملاء العمل 2 المشاريع متوسطة الحجم التي قد تكون بمثابة يغاندس لمستقبلات أفسس والتيروزين كيناز الزناد شلالات مستقبلات الإشارة. وأخيرا ، أكد تحليل PCR الحقيقي الوقت الذي يتم بفعل الجين الترميز لMSP – 32 – 1 في VSM (ok1468) المسوخ. أخذت معا ، وقد أظهرت الأبحاث التي يقوم بها المختبر في أن VSM – 1 المسوخ وزيادة كبيرة في كثافة متشابك ، والتي يمكن بوساطة إشارات MSP – 32.
في هذه الدراسة قمنا بتطوير وسيلة سهلة بروتوكول المستخدم ، الصديقة التي يمكن استخدامها لتحديد ملامح التعبير الجيني الكامن الظواهر البيولوجية المختلفة. في هذا البروتوكول ، وعزله للمرة الأولى RNA الكلي والمعالجة باستخدام الدناز أولا تم لدينا طريقة العزل RNA مبسطة بشكل كبير عن طريق حذف الاستخراج باستخدام راتنجات الفينول وتقارب 5،6 لتنظيف. لفترة وجيزة ، C. وكانت ايليجانس cuticule الخلية أغشية تصدع فتح بواسطة النيماتودا تجميد مع النيتروجين السائل وطحن مع الراتنج الجزيئية. كان يعامل المقبل ، مع استخراج الحمض النووي الريبي أنا الدناز قبل توليف [كدنا]. تم إضافة خطوة لاحقة للحد من التهجين غير محددة ؛ عينات الحمض النووي الريبي ملوثة الجيني يمكن أن أعرض التدخل وتنتج العديد من ايجابيات كاذبة. ثم اكتب البرية وVSM – 1 (ok1468) والموسومة cDNAs متحولة مع Cy3 والتقاط تسلسل Cy5 والمهجنة على C. ميكروأرس ايليجانس الحصول عليها من خلال برنامج GCAT. هذا النظام هو أكثر حساسية من المنتجات المماثلة ، وعلى اللونين تصميم يقلل من عدد من الالواح اللازمة ، مما أدى إلى مزيد من الوقت والتكلفة 7،8 الكفاءة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا النظام لا يتطلب معدات متخصصة لأنظمة أخرى مماثلة ، وبالتالي ، يمكن أن يتحقق هذا الإجراء في أي مكان المختبر القياسية 7. وحللت ، فلوري مجموعة صور المهجنة الثالثة باستخدام برمجيات المصدر المفتوح MAGICTool ، وخلقت ملامح التعبير الجيني. MAGICTool هو برنامج سهل الاستعمال التي يتم استخدامها بسهولة من قبل أفراد من جميع مستويات الخبرة ، من الجامعيين في مرحلة ما بعد الدكتوراه. ومع ذلك ، يتطلب الأداء الأمثل كبيرة توافر الذاكرة. أخيرا ، حصل مرشح الجينات باستخدام التحليل ميكروأري تم التحقق من صحتها مع PCR الوقت الحقيقي.
على الرغم من أن نهج الجينومية وسيلة فعالة لدراسة الظواهر البيولوجية ، وهناك بعض القيود ينبغي لأحد أن يأخذ بعين الاعتبار. أولا ، على الرغم من خصوصية هذا البروتوكول ميكروأري ومخطوطات داخل الأسرة لا يمكن تمييزها عن بعضها البعض إذا ما أخذ قليل النوكليوتيد طبعت من متواليات الحفظ. PCR الوقت الحقيقي يعوض عن أوجه التشابه الجيني داخل الأسرة ، ويمكن التمييز بين الأشكال الإسوية حتى محددة من الجين نفسه. ومع ذلك ، مع PCR الوقت الحقيقي وهو التحدي الحقيقي للعثور على الضوابط التي يتم التعبير عنها على قدم المساواة في جميع أنحاء عمر الكائن الحي. وبسبب هذا ، وسوف تكون النتائج النسبية. نهج البروتين هي واحدة بديلة لأسلوبنا. قد تكون معزولة البروتينات الفردية باستخدام 2D الكهربي الهلامي وتحديدها مع مطياف الكتلة.
دراستنا تظهر على وجه التحديد هي التي يسببها العديد من أعضاء الأسرة الحيوانات المنوية الرائد (MSP) البروتين في الديدان الخيطية VSM 1 – متحولة ذات الكثافة متشابك المحسنة. المشروعات المتوسطة الحجم هي فريدة من نوعها لجيم ايليجانس ، وهي المسؤولة عن نضج البويضة والإباضة. وقد أثبتت تشاي (1) التي تسيطر على الأرجح تنظيم عدد وحجم حبة قبل المشبكي عند تقاطع العصبية والعضلية في ذبابة الفاكهة التي تحتوي على جزيئات البروتين المجالات الرئيسية الحيوانات المنوية. وقد أثبتت الدراسات التي أجراها وزملاؤه تسودا 2 المجالات الرئيسية بروتين الحيوانات المنوية قد تكون بمثابة يغاندس لمستقبلات Ephrine مما اثار شلالات مستقبلات التيروزين كيناز الإشارة. علاوة على ذلك ، تحليل PCR الوقت الحقيقي والتحقق من صحة النتائج ميكروأري يضيق الخناق على عضو واحد من عائلة MSP ، MSP – 32. أخذت معا ، والعمل المقدم هنا يمثل تحليل الجينوم واسعة من معضلة الأعصاب المركزية وكذلك السلطة البحوث الجامعية في المسعى العلمي.
The authors have nothing to disclose.
تم تنفيذ هذا العمل من قبل الطلاب الجامعيين في جامعة ولاية ساوث جامعة أوكلاهوما ، ويذرفورد موافق. وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني RUI – 0963258 ، NIH OK – INBRE 2P20RR016478 ، وGCAT OCAST HR09 – 137S.
تم عزل (ok1468) vsm1 طافرة من قبل الضربة القاضية جين اتحاد أوكلاهوما.
المؤلفان بالشكر دان Stefanovic ويلر تانر للمساعدة القيمة التي قدموها أثناء تنفيذ المشروع.
Component | Catalog # | Company |
RNA Later | AM7020 | Ambion |
Molecular Grinding Resin | 786-138 | Gbiosciences |
RNeasy Mini Kit | 74104 | Qiagen |
Rnase-free Agarose LE | AM9040 | Ambion |
NorthernMax Gly 10X Gel Prep/Running Buffer | 8678 | Ambion |
RNA Millenium Marker | AM7150 | Ambion |
Glyoxal Sample Loading Dye | 8551 | Ambion |
DNase set | 79254 | Qiagen |
RNeasy MinElute Kit | 74204 | Qiagen |
RT Enzyme and 5X Reaction Buffer | RT300320 | Genisphere |
Array 350 | W300180 | Genisphere |
QIAquick PCR Purification Kit | 28104 | Qiagen |
20X SSC | 82021-4846 | VWR |
Sheared Salmon Sperm DNA | AM9680 | Ambion |
SDS Solution | V6551 | Promega |
DTT EM | 3860 | VWR |
iScript cDNA Synthesis Kit | 170-8890 | BioRad |
iQ SYBR Green Supermix | 170-8880 | BioRad |