जनरेशन और ट्रैकिंग अध्ययन के लिए Qdot Nanocrystals साथ murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं के लेबल
Summary
वृक्ष के समान कोशिकाओं तेज प्रतिजनों और प्रतिरक्षा करने के लिए टी कोशिकाओं को संसाधित प्रतिजनों वर्तमान अंगों की ओर विस्थापित. Qdot nanocrystal लेबलिंग एक लंबे समय से स्थायी और स्थिर फ्लोरोसेंट संकेत प्रदान करता है. इस वृक्ष के समान कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा विभिन्न अंगों के लिए ट्रैकिंग की अनुमति देता है है.
Abstract
वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) पेशेवर पेश प्रतिजन (APCs) कोशिकाओं परिधि के ऊतकों में और thymus, अस्थि मज्जा, प्लीहा, लिम्फ नोड्स और Peyer 1-3 पैच जैसे प्रतिरक्षाविज्ञानी अंगों में पाया हैं. DCs परिधि के ऊतकों के नमूने में प्रतिजनों की उपस्थिति है, जो वे ले, प्रक्रिया और प्रमुख उतक अनुरूपता अणुओं (MHC) के संदर्भ में उनकी सतह में मौजूद जीव मौजूद हैं. फिर, प्रतिजन लोड DCs प्रतिरक्षाविज्ञानी अंगों जहां वे टी लिम्फोसाइटों विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ट्रिगर करने के लिए प्रसंस्कृत प्रतिजन वर्तमान की ओर पलायन. DCs के प्रवासी क्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए एक तरीका उन्हें फ्लोरोसेंट 4 रंगों के साथ लेबल है .
इसके साथ हम Qdot फ्लोरोसेंट nanocrystals का उपयोग करने के लिए murine अस्थि – मज्जा व्युत्पन्न डीसी लेबल प्रदर्शित करता है. इस लेबलिंग का लाभ यह है कि Qdot nanocrystals स्थिर और लंबे समय तक चलने प्रतिदीप्ति कि उन्हें बरामद ऊतकों में लेबल कोशिकाओं का पता लगाने के लिए आदर्श बनाने के अधिकारी है. यह पूरा करने के लिए, पहली कोशिकाओं murine हड्डी marrows से बरामद किया जाएगा और granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक की उपस्थिति में 8 दिनों के लिए सभ्य क्रम में डीसी भेदभाव प्रेरित. इन कोशिकाओं को तो इन विट्रो ऊष्मायन में कम से फ्लोरोसेंट Qdots के साथ लेबल किया जाएगा. सना हुआ कोशिकाओं के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी visualized किया जा सकता. कक्ष में इस बिंदु पर प्रायोगिक पशुओं में इंजेक्ट किया जा सकता है है या पर इन विट्रो ऊष्मायन में परिपक्व कोशिकाओं में भड़काऊ उत्तेजनाओं के साथ किया जा सकता है . हमारे हाथ में, डीसी परिपक्वता फ्लोरोसेंट संकेत की हानि निर्धारित नहीं था और न ही करता है Qdot धुंधला DCs के जैविक गुणों को प्रभावित. इंजेक्शन पर, इन कोशिकाओं प्रतिरक्षा अंगों में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है ठेठ विच्छेदन और निर्धारण प्रक्रियाओं के बाद की पहचान.
Protocol
Discussion
Murine माइलॉयड) DCs बड़े पैमाने पर किया गया है क्रम में इस्तेमाल किया निर्धारित करने के लिए डीसी आधारित टीकों की प्रभावकारिता में सुधार; डीसी जांच: टी सेल बातचीत या डीसी विकास, और विभिन्न 9-11 रोगों में उनकी भूमिका का निर्धारण. इसके साथ हम बताएंगे कि कैसे उत्पन्न करने के लिए व्यापारियों से DCs tibias और femurs की हड्डी marrows से बरामद. हम सुझावों काटने के बिना हड्डियों को ठीक हो, हमें उन्हें 70% इथेनॉल में डुबकी द्वारा बाँझ की अनुमति, इस प्रकार संदूषण की संभावना को कम करने. अस्थि मज्जा की कोशिकाओं से DCs अंतर हम केवल 5 पहले से वर्णित के रूप में जीएम-CSF का उपयोग. हालांकि कुछ प्रोटोकॉल भी आईएल 4 का उपयोग करें, यह बताया गया है कि इस cytokine 12 जीएम-CSF के उच्च स्तर के साथ जब आवश्यक काम नहीं है. दरअसल, हम पहले दिखा दिया है कि इन DCs के लिए प्रतिरक्षा 13 प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने में सक्षम हैं. इसके अलावा, देखभाल करने के लिए मध्यम के साथ पेट्री डिश धोने द्वारा 8 दिन संस्कृतियों से ही शिथिल पक्षपाती कोशिकाओं को ठीक करने के लिए ले जाया जा के बाद से संलग्न कोशिकाओं monocyte तरह phenotype दिखा है. यहाँ हम DCs की लेबलिंग फ्लोरोसेंट Qdot कणों के साथ दिखाते हैं. यह लेबलिंग कुछ लाभ अन्य तरीकों के लिए सम्मान है. सबसे पहले, Qdots कणों को आसानी से कोशिकाओं में शामिल हैं. दूसरा, फ्लोरोसेंट संकेत बहुत अधिक है और डीसी परिपक्वता से बदल रहा है नहीं है. तीसरा, प्रतिदीप्ति जब कोशिकाओं या ऊतकों एसीटोन जैसे सॉल्वैंट्स, क्या होता है अगर GFP 14 DCs टैग प्रयोग किया जाता है, धुंधला प्रोटोकॉल का चयन करने के लिए पल में और अधिक लचीलापन दे रही है विपरीत के साथ तय कर रहे हैं खो नहीं है. अंत में, उच्च फ्लोरोसेंट इन कणों द्वारा दिए गए संकेत ऑटो प्रतिदीप्ति ऊतक के बावजूद कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देता है. जैसा कि पहले 6 वर्णित है, Qdot धुंधला में इन कोशिकाओं की परिपक्वता क्षमता को प्रभावित नहीं किया . इसके साथ हम बताते हैं कि Qdot से सना हुआ DCs गैर – दाग DCs के रूप में एक समान तरीके से व्यवहार करते हैं, costimulatory upregulating अणुओं, और भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में आईएल-6 और नाइट्रिक ऑक्साइड के उत्पादन. हालांकि DCs प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ट्रिगर में विशेष कोशिकाओं रहे हैं, वे कैंसर और 4 atherosclerosis, 15, 16 जैसे रोग की स्थिति में भाग लेने के लिए दिखाया गया है. उन्होंने यह भी किया गया है angiogenic प्रक्रिया 17, 18, भी structurally नए जहाजों 19, 20 के विकास में भाग लेने के रूप में सुझाव दिया है में भाग लेने का दावा किया. इस प्रकार, तरीकों कि डीसी vivo में ट्रैकिंग, और उनके विभिन्न ऊतकों 4, 21 में भौगोलिक स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए अनुमति देते हैं , 22 बहुत मूल्यवान हैं.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुदान CA137499 01-R15 (अमेरिकन प्लान) और ओहियो विश्वविद्यालय (अमेरिकन प्लान) से एक स्टार्टअप कोष के तहत इस काम NIH द्वारा भाग में समर्थित है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 mice | Jackson laboratories | Females, 6-8 weeks old | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-119 | |
| Fetal bovine serum, qualified | Invitrogen | 10437-028 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-096 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-049 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Walkersville, Inc | 10-548E | |
| Recombinant murine GM-CSF | PeproTech Inc | 315-03 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Invitrogen | Q25021MP | |
| Lipopolysaccharide | Invivogen | tlrl-eblps | |
| Recombinant murine TNF alpha | Peprotech | 315-01A | |
| CD86 antibody | BD Biosciences | 553691 | |
| CD40 antibody | BD Biosciences | 553791 | |
| Griess reagent system | Promega | G2930 | |
| IL-6 capture antibody | eBioscience | 13-7061-81 | |
| IL-6 detection antibody | eBioscience | 13-7062-81 |
Riferimenti
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