В режиме реального времени Электрические характеристики Сопротивление техника выполнения измерить Вторжение клеточный монослой эндотелиальных раковыми клетками

Summary

В этой статье описывается<em> В пробирке</em> Технике для контроля раковых клеток вторжение через монослой эндотелиальных клеток. Данные получают в режиме реального времени в зависимости от изменений импеданса на поверхности электродов на забое скважины.

Abstract

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host^1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors^4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process⁶. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.

Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes^7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance^9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.

The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

Protocol

1. Подготовка Все шаги должны быть выполнены в стерильных условиях в капюшоне культуры ткани. XCELLigence станция находится в 37 ° C инкубаторе в присутствии 5% CO 2. Использование низкого прохода HUVEC клетки, предпочтительно не более чем канал 6. Кроме того, убедитесь, что клетки являются не более чем на 75% сливной во время сбора урожая. HUVEC клетки выращивают в EGM-2 среды восстанавливают EGM-2 пули комплект (Lonza Biosciences), содержащий факторы роста, добавки и 5% фетальной бычьей сыворотки. Все следы трипсин должна быть удалена из суспензии клеток формованием клеток при 200xg, промыванием один раз PBS, и повторное суспендирование их в указанные плотности клеток. Coat xCELLigence E-пластины 16 с 0,1% желатина в течение 1 часа при температуре 37 ° С или в течение ночи при 4 ° С. Мойте тарелку с PBS и добавьте 100 мкл восстановленного EGM-2 СМИ. Выполните с контрольными замерами на xCELLigence системы для измерения фонаимпеданс в отсутствие клеток. 2. Создание HUVEC монослоя Урожай суб-сливающийся Настой HUVEC клетки трипсинизацией. Ресуспендируют клеток в восстановленной EGM-2 средства массовой информации до конечного плотностью 2,5 х 10 5 клеток / мл. В каждую лунку фон калиброванный E-планшет, содержащий 100 мкл EGM-2 среды, добавляют 100 мкл суспензии клеток HUVEC (2,5 × 10 4 HUVEC клетки). Немедленно установите E-Plate в xCELLigence инструмента. Программное обеспечение для выполнения xCELLigence импеданс показания с 10-минутными интервалами. Пусть эндотелиальные клетки расти в течение 18-21 часов, пока они не образуют монослой, о чем свидетельствует уплощение индекс ячейки (рис. 2). 3. Добавление вторжения в клетки и нормализация данных. После стабильного монослоя HUVEC сформировалась, урожай опухолевых клеток трипсинизацией и ресуспендируют до конечного притоновность 1 × 10 5 клеток / мл в среде для выращивания клеток опухоли (например, DMEM или RPMI, содержащей 10% FBS) Пауза импеданс показания xCELLigence программного обеспечения и удалить E-Plate от станции. Удалить EGM-2 СМИ аспирации. Добавьте 100 мкл суспензии клеток опухоли, содержащей 1 х 10 4 клеток. Как правило, соотношение 1:2,5 опухолевых клеток: эндотелиальные клетки высевают, лучше всего подходит для анализа. Однако это соотношение может быть оптимизирована для отдельных клеточных линий. Поместите E-пластина на xCELLigence системы в инкубаторе и продолжить сопротивление показания с 10-минутными интервалами. Вторжение можно отслеживать в режиме реального времени в течение следующих 6-12 часов, как капля в индекс ячейки из-за втягивания эндотелиальные соединения и проникновения вторжение опухолевых клеток. Нормализация результатов время добавления вторжение опухолевых клеток. XCELLigence программное обеспечение дает возможность нормализации в любую точку времени и результатыможет быть непосредственно рассматривать в окне программы. 4. Представитель Результаты: Примером HUVEC монослоя вторжения метастатического и не метастатических клеток показано на рисунке 3. K7M2 является метастатическим клеточной линии остеосаркомы. Эти клетки экспрессируют высокие уровни белка цитоскелета эзрина компоновщик, на долю которого приходится инвазивных свойств этой клеточной линии 13,14. Когда HUVEC клетки заражают K7M2 клетки, происходит падение электрического сопротивления в течение 6 часов. Это падение электрического сопротивления представляет вторжение в HUVEC монослоя вторжения в клетки опухоли. K12 клеточной линии, с другой стороны, выражает гораздо более низкие уровни эзрина и, следовательно, менее метастатических 13. Оспаривание HUVEC монослоя с K12 клетках приводит к менее резкое падение сопротивления как клетки не способны придерживаться или вторгаться через монослоя HUVEC (рис. 3). <imgSRC = "/ files/ftp_upload/2792/2792fig1.jpg" Alt = "Рисунок 1" /> Рисунок 1. Принципиальная схема работы процесса для вторжения эндотелиальных клеток опухолевыми клетками. HUVEC клетки высевают на покрытые желатином E-пластины и позволило сформировать монослой. Злокачественные клетки добавляются раз в монослой сформировался и инвазия контролируется в режиме реального времени, как индекс ячейки изменяется из-за вторжения в эндотелиальных монослой. Рисунок 2. HUVEC монослоя. Изменения в индекс ячейки как HUVEC клетки придают и распространяется на покрытые желатином золотыми электродами. Формирование монослоя представлен стабилизации клеточных индекс после 18 часов. Рисунок 3. Вторжение HUVEC клеток K7M2 и K12 клетки остеосаркомы. Резким сокращением челл индекса происходит в течение нескольких часов после введения высокой метастатической K7M2 клеток. K12 клетки, с другой стороны, менее метастатического и не могут проникать через монослой эндотелиальных же эффективно, как K7M2 клеток. Это представлено менее резкое снижение в клетке, когда индекс монослоя HUVEC стоит задача с K12 клеток. Управление представляет импеданс HUVEC монослоя в отсутствие раковых клеток. Эксперименты проводили в трех повторностях.

Discussion

В режиме реального времени вторжения HUVEC анализ является простой, но мощный метод мониторинга вторжения. Он предоставляет результаты в реальном времени, что является существенным преимуществом по сравнению с другими традиционными методами, которые опираются на анализ конечных результатов. Анализ может быть модифицирован, чтобы тестируемые лекарства, антитела, лиганды и белков в качестве ингибиторов или стимуляторов метастазов. Влияние различных агентов на эндотелиальных / раковых клеток перекрестных помех может быть оценена также. При введении экзогенных агентов, таких как факторы роста и препаратов в культуральной среде, важно, чтобы гарантировать, что они не оказывают влияния на целостность монослоя HUVEC. Разрушение монослоя HUVEC может быть проверена путем введения экзогенных агентов в отсутствие вторжения в клетки, и обеспечение того, нет никаких изменений в клеточной индекса. Таким образом, соответствующие элементы управления, должны быть включены как часть эксперимента.

Различные клеточные линии демонстрируют различные клетки-индекс кривые как они образуют конфluent монослоя. Форма кривой, а также максимальное клеточного индекс достигнута, является типом клеток конкретными. HUVEC клетки показывают характеристика переходных уплощение индекс ячейки 4-6 часов после посева, а затем еще стабилизации на более высоком индексе клетки после 16-18 часов. Следовательно, крайне важно, чтобы клетки образуют монослой по крайней мере 18 часов перед добавлением клеток опухоли.

Поскольку индекс ячейки зависит от ионной среде на границе электрод / клетка интерфазы различных факторов, таких как клеточной морфологии и качество межклеточных спаек влияние на клетки-индекс, в дополнение к области хорошо дно покрыты. Таким образом, снижение в ячейке индекс, который происходит при инвазии опухоли клетки, является функцией нескольких факторов, которые включают в себя отвода эндотелиальных соединений и последующее вторжение опухолевых клеток.

XCELLigence инструмент изготовлен в трех различных конфигурациях: анализатор реального времени клетки(RTCA) SP, MP и RTCA RTCA DP. Прибор RTCA SP занимает одно 96-а E-пластины в то время как прибор RTCA MP может вместить до шести 96-а E-пластин одновременно. Это позволяет для высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов и соединений. Эксперименты в этой статье, выполняются с помощью инструмента RTCA DP, которое можно провести три 16-а E-пластин. Каждая пластина E-Холдинг станция может самостоятельно работать, что позволяет многим пользователям запускать экспериментов одновременно. Прибор RTCA DP также может быть использован для изучения миграции с использованием CIM-пластин. Эти 16-луночных планшетах с верхней и нижней камеры, разделенные полиэтилентерефталата (ПЭТ) мембраны со средним размером пор 8um. Электронные датчики расположены на нижней пористой мембраны из верхней камеры. Нижняя камера служит в качестве резервуара для хемоаттрактантных для клеток в верхней камере. Тем не менее, одним из основных преимуществ HUVEC анализа вторжение на CIM пластины является то, что инвазии опухоли клетки в бывшем яы не ограничивается размером пор, как эндотелиальные инвазии клеток зависит от перекрестных помех между опухолью и эндотелиальных клетках.

HUVEC анализа вторжения может быть также выполнена на инструменте ЕСНГ Z, выпускаемых прикладной биофизики (Троя, штат Нью-Йорк). Прибор ЕСНГ Z использует технологию, подобную xCELLigence инструментом, с различиями в массиве и конфигурации электродов. Мы успешно выступили HUVEC анализов вторжения помощью 8-и массивы Восточной Европы и СНГ. Важно отметить, что хорошо нижней поверхности область больше, в ЕСНГ массивы, который требует большего числа эндотелиальных и опухолевых клеток, что покрытие: 2,5 × 10 ⁵ и 1 × 10 ⁵ клеток соответственно.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
xCELLigence RTCA DP station	Roche	05469759001
RTCA control unit	Roche	05454417001	Notebook with preinstalled RTCA software
E-Plate 16	Roche	05469830001
HUVEC cells	Lonza	CC-2517
EGM-2 media	Lonza	CC-3156
EGM-2 bullet kit	Lonza	CC-4176
0.1% Gelatin in sterile H2O	Millipore	MCPROTO045