Vibratome Sektionering för förbättrade Bevarande av Cytoarchitecture av Mammalian organ Corti
Summary
Ett enkelt förfarande vibratome sektionering organ för Corti, följt av immunohistokemi och konfokalmikroskopi beskrivs. Detta förfarande möjliggör bättre bevara den fina cytoarchitecture av däggdjur organ Corti, och därmed tillåter en exakt kvantifiering av celltyper.
Abstract
Den däggdjur organ Corti är en mycket beställde cellulär mosaik av mechanosensory hår och nonsensory stödja celler
(Över 1,2). Visning av denna cellulära mosaik kräver ofta att organ Corti är cross-delad. I synnerhet kan nonsensory pelaren och Deiters "celler, vars kärnor är belägna basally med avseende på hårcellerna, inte visualiseras utan tvärsnitt av organ Corti. Dock är den känsliga cytoarchitecture av däggdjur organ Corti, inklusive den fina cytoplasmiska processer pelaren och Deiters "celler, svåra att bevara genom rutinmässig histologisk förfaranden som paraffin och Cryo-sektionering, som är kompatibla med standard immunhistokemisk färgning tekniker.
Här beskriver jag en enkel och robust som består av vibratome sektionering av snäckan, immunhistokemisk färgning av dessa vibratome avsnitt i hela berget, följt av konfokalmikroskopiska. Detta förfarande har använts i stor utsträckning för immunhistochemical analys av flera organ, inklusive musen lem knoppen, zebrafisk tarmar, lever, bukspottkörtel och hjärta (se 3-6 för utvalda exempel). Dessutom var detta förfarande framgångsrik för både imaging och quantitificaton av pelare cell nummer i mutant och kontroll organ Corti både embryon och vuxna möss 7. Denna metod är dock för närvarande inte så vanligt att undersöka däggdjur organ Corti. Potentialen för detta förfarande för att både ge ökad bevara den fina cytoarchitecture av den vuxna organ Corti och möjliggöra kvantifiering av olika celltyper beskrivs.
Protocol
Discussion
Förfarandet för vibratome snittning, följt av immunohistokemi och konfokala bildhantering möjliggör visualisering av organ Corti med minimal vävnadsskada. Klart, konfokal bilder tagna från interna regioner i vibratome avsnitt visar utmärkt bevarandet av cellulära morfologi som begränsas endast av fixering artefakter. Konfokala bilder som tas nära två cut-ytor av en vibratome avsnitt är ofta omöjlig att skilja från bilder från interna regioner, även om enstaka cellulära störningar, exempelvis avbrott i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författaren vill tacka för användning av Barnens Forskningsinstitut Imaging Core för konfokalmikroskopi och Dr Jian Zhang för förslaget att montera delar med agaros pärlor. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag DC010387.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Zeiss | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
Riferimenti
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60, 397-422 (2003).
- Chung, W. S., Shin, C. H., Stainier, D. Y. Bmp2 signaling regulates the hepatic versus pancreatic fate decision. Dev Cell. 15, 738-748 (2008).
- Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development. Nature. 418, 501-508 (2002).
- Trinh, L. A., Stainier, D. Y. Fibronectin regulates epithelial organization during myocardial migration in zebrafish. Dev Cell. 6, 371-382 (2004).
- Yin, C., Kikuchi, K., Hochgreb, T., Poss, K. D., Stainier, D. Y. Hand2 regulates extracellular matrix remodeling essential for gut-looping morphogenesis in zebrafish. Dev Cell. 18, 973-984 (2010).
- Shim, K., Minowada, G., Coling, D. E., Martin, G. R. Sprouty2, a mouse deafness gene, regulates cell fate decisions in the auditory sensory epithelium by antagonizing FGF signaling. Dev Cell. 8, 553-564 (2005).
