Hele Mount<em> In situ</em> Hybridisatie van E8.5 aan E11.5 muis embryo's
Summary
Deze hele mount<em> In situ</em> Hybridisatie protocol bespreekt kritische stappen die reproduceerbare resultaten van hoge kwaliteit voor genexpressie studies te waarborgen in E8.5-E11.5 dagen oude muis embryo's.
Abstract
Whole mount in situ hybridisatie is een zeer informatieve benadering voor het definiëren van genexpressie patronen in embryo's. De in situ hybridisatie procedures lang zijn en technisch veeleisend met meerdere belangrijke stappen die gezamenlijk bijdragen aan de kwaliteit van het eindresultaat. Dit protocol beschrijft in detail een aantal belangrijke kwaliteitscontrole stappen voor het optimaliseren van sonde etikettering en prestaties algemeen., Ons protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van de kritische stappen die nodig zijn om reproduceerbaar te verkrijgen resultaten van hoge kwaliteit. Eerst beschrijven we de generatie van digoxigenine (DIG) gemerkte RNA probes via in vitro transcriptie van DNA templates gegenereerd door PCR. We beschrijven drie kritische kwaliteitscontrole assays om de hoeveelheid, integriteit en specifieke activiteit van het DIG gemerkte probes bepalen. Deze stappen zijn belangrijk voor het genereren van een probe voldoende gevoeligheid voor endogene mRNA te detecteren in een geheel muizenembryo.Daarnaast beschrijven we methoden voor de fixatie en opslag van E8.5-E11.5 dagen oude muizenembryo's in situ hybridisatie. Vervolgens beschrijven we Methoden voor beperkte proteinase K digestie van het gerehydrateerde embryo gevolgd door de gegevens van de hybridisatieomstandigheden, post-hybridisatie wassingen en RNase behandeling van niet-specifieke probe hybridisatie verwijderen. Een AP-geconjugeerd antilichaam wordt gebruikt om de gelabelde probe visualiseren en het expressiepatroon van de endogene transcript onthullen. Representatieve resultaten worden getoond van succesvolle experimenten en typische suboptimale experimenten.
Protocol
Discussion
De methoden die in dit protocol zijn op basis van een aantal verschillende bronnen en geoptimaliseerd voor ganse berg E8.5-E11.5 dagen oude muis embryo's. Methoden voor het ganse berg in situ hybridisatie van gewervelde embryo's verscheen voor het eerst in de vroege jaren 1990 2,5-12. Dit protocol werd aangepast hoofdzakelijk van methoden ontwikkeld voor Xenopus embryo 7,8 en muis 2,11. In ons protocol veel nadruk wordt gelegd op zorgvuldige kwaliteitsbeoordeling van de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R21MH082360 (BGC) en R01HD056315 (NRM) en de Universiteit van Georgia.
Materials
| Name | Tipo | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate | Reagent | Roche | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National scientific | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisherbrand | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisherbrand | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
Riferimenti
- Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
- Logel, J., Dill, D., Leonard, S. Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA. Biotechniques. 13, 604-610 (1992).
- Maddox, D. M., Condie, B. G. Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development. BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).
- Conlon, R. A., Rossant, J. Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo. Development. 116, 357-368 (1992).
- Krauss, S. Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube. EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).
- Hemmati-Brivanlou, A. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110, 325-330 (1990).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Herrmann, B. G. Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos. Development. 113, 913-917 (1991).
- Conlon, R. A., Herrmann, B. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts. Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).
- Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development. 119, 247-261 (1993).
- Rosen, B., Beddington, R. S. Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions. Trends Genet. 9, 162-167 (1993).
- Quiring, R. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Neidhardt, L. Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos. Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal. 103, 141-143 (2001).
