この全体のマウント<em>その場で</em>ハイブリダイゼーションプロトコルは、E8.5、E11.5日齢のマウス胚において遺伝子発現研究のための再現性の高品質な結果を確保するための重要なステップを説明します。
in situハイブリダイゼーションホールマウントは、胚における遺伝子発現パターンを定義するための非常に有益なアプローチである。 in situハイブリダイゼーションの手順で 、長く技術的に一括して最終結果の質の向上に寄与する複数の重要なステップで求められています。 このプロトコルを詳細にプローブのラベリングとパフォーマンスを最適化するためのいくつかの重要な品質管理手順を説明します。全体的に、我々のプロトコルは、詳細な説明を提供しています再現性よく高品質な結果を得るために必要な重要なステップの。まず、PCRによって生成されたDNA鋳型のインビトロ転写を介して、ジゴキシゲニン(DIG)標識RNAプローブの生成を説明します。我々は、量、整合性とDIG標識プローブの比活性を決定するために、3つの重要な品質管理検定法を説明します。これらの手順では、全体のマウス胚における内因性mRNAを検出するために十分な感度のプローブを生成するために重要である。加えて、我々はin situハイブリダイゼーションのためのE8.5-E11.5日齢のマウス胚の固定とストレージのための方法について説明します。そこで我々は、非特異的なプローブハイブリダイゼーションを削除するには、ハイブリダイゼーション条件、ハイブリダイゼーション後の洗浄とRNase処理の詳細は、続いて再水和された胚の限られたプロテイナーゼK消化のための詳細な方法について説明します。 AP標識抗体が標識されたプローブを可視化し、内因性の転写産物の発現パターンを明らかにするために使用されます。代表的な結果は、成功した実験と典型的な次善の実験から示されています。
このプロトコルで説明する方法は、さまざまなソースから適応し、ホールマウントE8.5-E11.5日齢のマウスの胚に最適化されています。脊椎動物の胚のin situハイブリダイゼーションホールマウントするための方法は、まず、1990年代初頭2,5-12で登場しました。このプロトコルは、主にアフリカツメガエル胚7,8と同様にマウス2,11のために開発された方法から脚…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、NIHの助成R21MH082360(BGC)とR01HD056315(NRM)と同様にジョージア大学によってサポートされていました。
Name | Tipo | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|---|
Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate | Reagent | Roche | 11209256910 | |
Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche | 11277057001 | |
Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche | 11274015001 | |
T7 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10881767001 | |
SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10810274001 | |
T3 RNA polymerase | Reagent | Roche | 11031163001 | |
CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche | 4716728001 | |
Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher | BP169-500 | |
Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene | ||
Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma | D5758-100ML | |
Heparin sodium | Reagent | Acros | 41121-0010 | |
hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher scientific | BP2633-500 | |
Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
Blocking reagent | Reagent | Roche | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
Proteinase K | Reagent | Roche | 3115852001 | |
Rnase A | Reagent | Roche | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
Rnase T1 | Reagent | Roche | 10109193001 | |
Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche | 11093274910 | |
BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche | 11 442 074 001 | |
4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National scientific | B7800-2 | |
Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisherbrand | 15-200-402C | |
Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisherbrand | 23-021-400 | |
Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences | 18646A | |
Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisherbrand | 12-550-17 | |
Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma | N8002 | |
Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |