Tüm Dağı<em> In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve> Hibridizasyon
Summary
Bütün bu montaj<em> In situ</em> Hibridizasyon protokolü E8.5-E11.5 günlük fare embriyoları gen ekspresyon çalışmaları için tekrarlanabilir, yüksek kaliteli sonuçlar sağlamak kritik adımları anlatılmaktadır.
Abstract
In situ hibridizasyon Tüm monte embriyolar gen ifade desenlerinin tanımlanmasına yönelik çok bilgilendirici bir yaklaşımdır. Situ hibridizasyon işlemlerinde uzun ve teknik olarak topluca nihai sonucun kalitesine katkıda birden önemli adımlar ile zorlu. Bu protokol prob etiketleme ve performansını optimize etmek için ayrıntılı birkaç önemli kalite kontrol adımları açıklar. Genel olarak, bizim protokol ayrıntılı bir açıklamasını sunar gerekli kritik adımlar tekrarlanabilir yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek. İlk olarak, PCR tarafından üretilen DNA şablonları in vitro transkripsiyon yoluyla digoxygenin (DIG) etiketli probların RNA üretimini açıklıyoruz. Bu miktar, bütünlüğü ve DIG-etiketli problar spesifik faaliyetini belirlemek için üç kritik kalite kontrol testlerinin açıklanmaktadır. Bu adımlar bir bütün fare embriyo endojen mRNA'ların tespit etmek için yeterli hassasiyet prob üretmek için önemlidir.Ayrıca, in situ hibridizasyon için E8.5-E11.5 günlük fare embriyo fiksasyon ve depolama yöntemleri açıklanmaktadır. Daha sonra, hibridizasyon koşulları, hibridizasyon sonrası yıkamalar ve non-spesifik hibridizasyon probu kaldırmak için RNaz tedavi ayrıntılar, ardından suyla yeniden embriyoların sınırlı proteinaz K sindirimi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. AP-bağlı antikor etiketli sonda görselleştirmek ve endojen transkript salgılama modelini ortaya çıkarmak için kullanılır. Temsilcisi sonuçları başarılı deneyler ve tipik suboptimal deneylerden gösterilmiştir.
Protocol
Discussion
Bu protokolü açıklanan yöntemler farklı kaynaklardan bir dizi uyarlanmış ve tüm montaj E8.5-E11.5 günlük fare embriyoları için optimize edilmiştir. Omurgalı embriyolarının in situ hibridizasyon tüm montaj yöntemleri ilk 1990'ların başında 2,5-12 ortaya çıktı. Bu protokol öncelikle Xenopus embriyolar 7,8 yanı sıra fare 2,11 için geliştirilen yöntemler uyarlanmıştır. Bizim protokol vurgu büyük bir prob dikkatli kalite değerlendirmesi üzerin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe R21MH082360 (BGC) ve R01HD056315 (UYM) yanı sıra Georgia Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Tipo | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| Digoxigenin-11-uridine-5′-triphosphate | Reagent | Roche | 11209256910 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set | Reagent | Roche | 11277057001 | |
| Quick Spin Columns for radiolabeled RNA purification | Supply | Roche | 11274015001 | |
| T7 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10881767001 | |
| SP6 RNA polymerase | Reagent | Roche | 10810274001 | |
| T3 RNA polymerase | Reagent | Roche | 11031163001 | |
| CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCi | Reagent | Perkin Elmer | BLU008X250UC | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Reagent | Roche | 4716728001 | |
| Urea,Colorless-to-white Crystals or Crystalline Powder | Reagent | Fisher | BP169-500 | |
| Gel loading buffer | Reagent | Ambion | AM8547 | |
| Hybond-N+, Amersham | Supply | GE Healthcare | RPN82B | |
| UV Stratalinker 2400 | Equipment | Stratagene | ||
| Diethyl pyrocarbonate | Reagent | Sigma | D5758-100ML | |
| Heparin sodium | Reagent | Acros | 41121-0010 | |
| hydrogen peroxide 30% in water | Reagent | Fisher scientific | BP2633-500 | |
| Gluteraldehyde, 8% EM grade | Reagent | Polysciences | 0/710 | Use with caution according to manufacture’s instructions |
| Blocking reagent | Reagent | Roche | 11096176001 | Make into 5% stock and store at -20° C |
| Proteinase K | Reagent | Roche | 3115852001 | |
| Rnase A | Reagent | Roche | 10109142001 | Make as 10 mg/ml stock and store at -20° C. |
| Rnase T1 | Reagent | Roche | 10109193001 | |
| Ultrapure Formamide | Reagent | Invitrogen | 15515-026 | |
| Levamisole hydrochloride | Reagent | ICN Biomedicals. Inc | 155228 | |
| Ribonucleic acid from torula yeast,Type VI | Reagent | Sigma | R6625 | phenol/chloroform extracted several times and precipitated, resuspended in DEPC-dH2O and stored at -20° C |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments | Reagent | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple AP Substrate, precipitating. Ready-to-use solution. | Reagent | Roche | 11 442 074 001 | |
| 4mL, Clear, Closed Top, Storage Vial Convenience Kit | Supply | National scientific | B7800-2 | |
| Shake N Bake hybridization oven | Equipment | Boekel Scientific | 136400 | |
| Biopsy Sure-Tek | Supply | Fisherbrand | 15-200-402C | |
| Paraplast Plus tissue embedding medium | Reagent | Fisherbrand | 23-021-400 | |
| Peel-A-Way disposable plastic tissue embedding molds | Supply | Polysciences | 18646A | |
| Colorfrost Plus Microscope slides | Supply | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Nuclear Fast Red | Reagent | Sigma | N8002 | |
| Cytoseal 60 | Reagent | Richard-Allan Scientific | 8310-16 |
Riferimenti
- Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
- Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
- Logel, J., Dill, D., Leonard, S. Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA. Biotechniques. 13, 604-610 (1992).
- Maddox, D. M., Condie, B. G. Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development. BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).
- Conlon, R. A., Rossant, J. Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo. Development. 116, 357-368 (1992).
- Krauss, S. Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube. EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).
- Hemmati-Brivanlou, A. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110, 325-330 (1990).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Herrmann, B. G. Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos. Development. 113, 913-917 (1991).
- Conlon, R. A., Herrmann, B. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts. Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).
- Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development. 119, 247-261 (1993).
- Rosen, B., Beddington, R. S. Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions. Trends Genet. 9, 162-167 (1993).
- Quiring, R. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Neidhardt, L. Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos. Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal. 103, 141-143 (2001).
