Gli sforzi per isolare la subunità catalitica della telomerasi, TERT, in quantità sufficienti per studi strutturali, sono stati accolti con scarso successo da oltre un decennio. Qui, vi presentiamo i metodi per l'isolamento dei ricombinanti Tribolium castaneum TERT ( Tc TERT) e la ricostituzione del principio attivo T. castaneum Ribonucleoproteina telomerasi (RNP) complesso In vitro.
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Articolo metodologico
Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli sforzi per isolare la subunità catalitica della telomerasi, TERT, in quantità sufficienti per studi strutturali, sono stati accolti con scarso successo da oltre un decennio. Qui, vi presentiamo i metodi per l'isolamento dei ricombinanti Tribolium castaneum TERT (Tc TERT) e la ricostituzione del T. attivo castaneum telomerasi ribonucleoproteina (RNP) complessi in vitro.
La telomerasi è una trascrittasi inversa specialisti 1 che aggiunge ripete DNA brevi, chiamate telomeri, porre fine al 3 'dei cromosomi lineari 2 che servono per proteggerli da end-to-end di fusione e di degrado. A seguito di replicazione del DNA, un breve segmento è perso alla fine del cromosoma 3 e senza telomerasi, le cellule continuare a dividere fino alla fine raggiungendo il limite Hayflick 4. Inoltre, la telomerasi è latente nella maggior parte delle cellule somatiche 5 in adulti, ma è attiva nelle cellule tumorali 6, dove si promuove l'immortalità delle cellule 7.
L'enzima telomerasi minimo è costituito da due componenti principali: la subunità proteiche (TER), che comprende la subunità catalitica dell'enzima e parte integrante di RNA (TER), che contiene il TERT modello utilizza per sintetizzare i telomeri 8,9. Fino al 2008, solo le strutture per i domini telomerasi individuo era stato risolto 10,11. Un importante passo avanti in questo campo è venuto dalla determinazione della struttura cristallina dei 12 attivi, subunità catalitica di T. castaneum telomerasi, Tc TERT 1.
Qui, vi presentiamo i metodi per la produzione di grandi quantità del principio attivo, TERT solubile Tc per studi strutturali e biochimici, e la ricostituzione del complesso RNP telomerasi in vitro per analisi attività della telomerasi. Una panoramica dei metodi sperimentali utilizzati è mostrata in Figura 1.
Protocollo
1. Espressione di ricombinante TERT Tc
- Inoculare 6 L di 2YT multimediali (6 x 2 L Perplesso beute contenenti 1 l di brodo 2YT in ciascuno) da sei piatti freschi di cellule trasformate pLysS Rosetta (DE3) contenente la sintesi Tc TERT plasmide con un TEV cleavable N-terminale hexahistidine- tag.
- Crescere le cellule a 37 ° C sotto agitazione a 220 rpm in un OD 600 di 0,5-0,6.
- Indurre l'espressione delle proteine con l'aggiunta di 1 mM IPTG.
- Ridurre la temperatura a 30 ° C, lenta agitazione a 150 rpm, e consentono alle cellule di esprimere la proteina per 4-5 h.
- Celle di raccolta per centr....
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Discussione
Il metodo presentato qui permette la produzione di grandi quantità della subunità catalitica di T. castaneum TERT telomerasi nelle solubile, forma attiva per studi strutturali e biochimici. Il metodo di Tc TERT sovra-espressione è sensibile ai cambiamenti sottili di temperatura o la densità delle cellule da quelle di cui sopra e possono influenzare notevolmente i livelli di espressione della proteina. In particolare, abbiamo trovato che inducono le cellule per l'espressione delle proteine prima c.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
La ricerca qui presentata è stata supportata dal Dipartimento della Salute della Pennsylvania, Il Medical Ellison, V e I fondamenti Smeraldo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| Rosetta (DE3) plysS Cellule | Novagen | 70956 | |
| 2YT brodo | Teknova | Y0215 | |
| IPTG | Oro Biotecnologie | I2481C | |
| Misonix Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | ||
| Akta Purificatore FPLC | GE Life Sciences | ||
| Ni-NTA Superflow Resina | Qiagen | 30410 | |
| Amicon Ultra-15 dispositivo centrifuga Filtro | Millipore | UFC903008 | |
| POROS 50 HS scambio cationico forte Imballaggio | Applied Biosystems | 1-3359-06 | |
| POROS 50 HQ scambio cationico forte Imballaggio | Applied Biosystems | 1-2559-06 | |
| Superdex 200 10/300 Dimensione-esclusione Colonna | GE Life Sciences | 17-5175-01 | |
| Fenolo: cloroformio: Isoamyl 25:24:1 con 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA | Sigma | P3803-100 ml | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| Ricombinante l'inibitore della ribonucleasi Rnasin | Promega | N251B | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| DNA oligonucleotidi | Integrated DNA Technologies |
Riferimenti
- Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455, 633-637 (2008).
- Greider, C. W., Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extra....
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Ristampe e permessi
