Immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale
Summary
Vi presentiamo un metodo per immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale. L'approccio può essere utilizzata per identificare specifici siti di legame fattore di trascrizione e di importanti modificazioni epigenetiche degli istoni e del DNA per la rigenerazione degli assoni danneggiati sia nel sistema nervoso periferico e centrale.
Abstract
Assoni nel sistema nervoso centrale (SNC), non si rigenerano, mentre quelli del sistema nervoso periferico (PNS) si rigenerano in misura limitata dopo l'infortunio (Teng et al., 2006). Si riconosce che i programmi trascrizionali essenziali per la crescita dei neuriti e assonale vengono riattivati su lesioni in PNS (Makwana et al., 2005). Tuttavia gli strumenti disponibili per analizzare regolazione neuronale gene in vivo sono limitati e spesso difficile.
Gangli delle radici dorsali (DRG) offrono un ottimo sistema modello lesioni perché sia il SNC e SNP sono innervate da un assone biforcata provenienti dal soma stesso. I gangli rappresentano una discreta collezione di corpi cellulari in cui tutti gli eventi trascrizionali si verificano, fornendo così una regione ben definita di attività trascrizionale che possono essere facilmente riproducibile e rimosso dall'animale. Lesioni delle fibre nervose nel PNS (es. nervo sciatico), dove la rigenerazione assonale si verifica, dovrebbe rivelare un insieme di programmi trascrizionali che sono distinti da quelli rispondendo a un infortunio simile nel sistema nervoso centrale, in cui la rigenerazione non avviene (per esempio il midollo spinale ). Siti di legame per il fattore di trascrizione, modificazione degli istoni e DNA derivati da lesioni al sistema nervoso centrale sia PNS o possono essere caratterizzati con immunoprecipitazione della cromatina (ChIP).
Qui, descriviamo un protocollo ChIP utilizzando tessuti fissati DRG del mouse seguente danno assonale. Questa potente combinazione fornisce un mezzo per caratterizzare la pro-ambiente di rigenerazione cromatina necessario per promuovere la rigenerazione assonale.
Protocol
Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo per chiedere direttamente sull'ambiente cromatina durante la rigenerazione assonale nel sistema nervoso adulto seguenti danno assonale. Incorpora il modello DRG lesioni con immunoprecipitazione della cromatina per sondare l'ambiente trascrizionali ed epigenetici successive a lesioni sia alla PNS e CNS. E 'particolarmente utile per gli investigatori che vogliono caratterizzare putativi siti di legame per il loro fattore di trascrizione preferiti, e per determinare se l'…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Andrea Tedeschi per un aiuto nel fissare gli esperimenti ChIP iniziale in laboratorio e Ricco Lindner per il suo contributo per mettere a punto le condizioni per la ChIP. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Hertie; Grant Fortuna, Università di Tuebingen, e la DFG DI concede 1497/1-1 (tutti concessi a Simone Di Giovanni).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
Riferimenti
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
