세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근
Summary
여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
모두 기초 및 임상 신경 과학에 대한 근본적인 목표는 더 신원, 분자 메이크업, 그리고 정상과 질병 뇌 모두에서 뉴런에 특징 아르 연결의 패턴을 이해하는 것입니다. 이 무렵, 노력의 다량은 고해상도 neuroanatomical지도 1-3 건물에 위치하고 있습니다. 분자 유전학 가벼운 현미경의 진보의 확장의 연결 morphologies뿐만 아니라 쿼리 수있는 능력을 올뿐만 아니라, 개별 뉴런과 연결된 네트워크 4 분자 및 세포 메이크업이되고있다. 설치류의 유전자 변형과 유전자 타겟팅 기술을 통해 뉴런을 표시하고 조작할 수있는 능력의 주요 발전은 이제합니다 5-6에서 '프로그램'의 연결 집합에 수사관을 허용합니다. 확실하게, 현대 신경 과학에 가장 영향력있는 공헌 중 하나는 필수 기자의 끊임없이 확장 도구 상자 9 항복을 7-8, 그들의 후속 기술과 함께 해양 무척추 동물에 형광 단백질 (FPS) 인코딩 유전자의 발견 및 복제되었습니다. 이산의 연결 인구에서 타겟 FP 표현을 드라이브에 활용 세포 유형의 특정 발기인 활동은 이제 유전자 정밀 neuroanatomical 조사를 내실수가 있었죠.
뉴런의 엔지니어링 FP 표현은 크게 뇌의 구조와 기능에 대한 우리의 이해를 향상되었습니다. 그러나, 깊은 뇌 조직에, 또는 3 차원 영상 개별 뉴런과 관련 네트워크, 도전 남아있다. 높은 지질 내용으로 인해, 신경 조직 오히려 불투명 전시 자동 형광입니다. 이러한 고유 biophysical 속성은 어려운 미크론 수십의 깊이 이상의 표준 epifluorescent 또는 공촛점 현미경을 사용하여 높은 해상도에서 찬란 분류 뉴런을 시각화 및 이미지를합니다. 이 과제의 수사를 회피하기 위해서는 종종 일련 박막 섹션 이미징 및 재건 방법 10, 또는 2 광자 레이저 스캐닝 현미경 11 사용합니다. 이러한 방식으로 현재의 단점은 각각 관련 노동 집약적인 조직을 준비하거나, 비용 금지 기기입니다.
여기서는 광학 삭제 및 이미징에 의해 고정 세미 두께 마우스 뇌 조각의 찬란 레이블 세포를 시각화하기 위해 상대적으로 신속하고 간단한 방법을 제시한다. 첨부된 프로토콜에서는의 방법을 설명합니다 intracardial 재관류, 2) 해부 및 전체 두뇌의 제거, 3) 아가로 오스, 4 고정 뇌 포함) 새로운 vibratome 장비를 사용하여 정밀 세미 두꺼운 슬라이스 준비를 통해 현장에서 1) 고정 뇌 조직 , 5) 정산 두뇌 글리세롤 기울기를 통해 조직, 그리고 6) 가벼운 현미경과 Z – 스택 재건 (그림 1) 유리 슬라이드에 장착.
뇌 조각을 준비하는 동안 우리는 장비의 새로운 작품은 'Compresstome'VF – 200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html)를 호출 구현했습니다. 이 악기는 다른 vibratomes 함수를 유사한 기능을 갖춘 전동 사전 및 블레이드 진동 시스템을 갖춘 세미 자동 마이크로톰입니다. 다른 vibratomes 달리 얇게하는 조직은 스테인레스 스틸 실린더 내에 아가로 오스 플러그인에 마운트됩니다. 조직 원하는 실린더의 두께로 압출하고, 앞으로 발전 진동 칼날에 의해 절단. 아가로 오스 플러그 / 실린더 시스템은 재현성 조직이 장착 정렬 및 정밀 가공을위한 수 있습니다. 우리 손 안에있는 'Compresstome'수율은 전기 생리학, immunohistochemistry를위한 고품질의 조직 슬라이스하고, 직접 고정 조직 실장 및 이미징. 광학 삭제와 함께, 우리가 고해상도 형광 이미징을위한 세미 두께 고정 뇌 조각의 준비를 보여줍니다.
Protocol
Discussion
가벼운 현미경에 빠르게 화면, 이미지, 손상 뇌 조직 내의 신경 네트워크 분석은 귀중한되어 필요를 통해 조사의 연결 집합을 대상으로 형광 단백질을 사용하는 광범위한 응용 프로그램을 감안할 때.
사용자 친화적인 생체내 electroporation 기법에 바이러스성 벡터, 그리고 유전자 변형 마우스 종자의 개발에 기술적인 진보는 이제 조사를 표시 셀 종류의 겉보기 무…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 맥네어 재단, NARSAD, 그리고 NINDS 부여 R00NS064171 – 03을 통해 지원이 투자되었다.
Materials
| Name of the item | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| bone scissors | F.S.T. | 16044-10 | -or equivalent |
| dissection scissors | F.S.T. | 14084-08 | -or equivalent |
| type I-B agarose | Sigma | A0576 | |
| Compresstome | Precisionary Instruments | VF-200 | -other vibratomes are compatible |
| double sided adhesive | Grace Bio-Labs | SA-S-1L | |
| Superfrost Plus slides | VWR | 48311-703 | |
| Cover glass | VWR | 48383-139 | |
| glycerol | EMD Chemicals Inc. | GX0185-6 | -or equivalent |
Riferimenti
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