Qui si descrive un metodo rapido e semplice per celle di immagine fluorescente in semi-densi fettine di cervello. Fissando, affettare, e otticamente compensazione tessuto cerebrale si descrivono le modalità standard di imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule e reti neuronali all'interno intatto tessuto nervoso.
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Articolo metodologico
Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un obiettivo fondamentale sia di base e clinica delle neuroscienze è quello di comprendere meglio le identità, trucco molecolare, e modelli di connettività che sono caratteristici di neuroni nel cervello sia normale e malato. In questo senso, un grande sforzo è stato posto sulla costruzione di mappe ad alta risoluzione neuroanatomici 1-3. Con l'espansione della genetica molecolare e progressi nella microscopia luce è venuta la possibilità di interrogare non solo morfologie neuronale, ma anche la composizione molecolare e cellulare dei singoli neuroni e delle loro reti associate 4. Importanti progressi nella capacità di segnare e manipolare i neuroni attraverso le tecnologie transgeniche e gene targeting nei roditori ora consentire agli investigatori di sottoinsiemi neuronale 'programma' a volontà 5-6. Probabilmente, uno dei contributi più influenti di neuroscienza contemporanea è stata la scoperta e la clonazione di geni che codificano per proteine fluorescenti (PQ) in invertebrati marini 7-8, accanto ai loro ingegneria successive per produrre una sempre maggiore cassetta degli attrezzi di giornalisti vitale 9. Sfruttando cellula tipo-specifici promotore di attività mirate a guidare l'espressione FP in discrete popolazioni neuronali offre ora indagine neuroanatomici con precisione genetica.
Ingegneria espressione FP nei neuroni ha migliorato notevolmente la nostra comprensione della struttura del cervello e funzione. Tuttavia, i singoli neuroni imaging e le loro reti associate nei tessuti cerebrali profondi, o in tre dimensioni, è rimasta una sfida. A causa di alto contenuto di lipidi, tessuto nervoso è piuttosto opaco e auto presenta fluorescenza. Queste proprietà intrinseche biofisiche rendono difficile la visualizzazione e l'immagine neuroni fluorescente ad alta risoluzione con un microscopio confocale epifluorescente o al di là profondità di decine di micron. Per aggirare questo problema i ricercatori spesso utilizzano seriale sottile sezione imaging e metodi di ricostruzione 10, o 2-fotone microscopia a scansione laser 11. Svantaggi attuali a questi approcci sono associati alta intensità di lavoro di preparazione dei tessuti, o troppo costose strumentazioni rispettivamente.
Qui, vi presentiamo un metodo relativamente rapido e semplice per visualizzare le cellule fluorescente a fette topo fisso semi-densi cervello deselezionando ottici e di imaging. Nel protocollo allegato si descrivono i metodi di: 1) tessuto cerebrale di fissaggio in situ tramite perfusione intracardial, 2) la dissezione e la rimozione di intero cervello, 3) incorporando cervello stazionario in agarosio, 4) di precisione semi-densi preparazione fetta utilizzando nuovi strumenti vibratome compensazione, 5) il tessuto cerebrale da un gradiente di glicerolo, e 6) il montaggio su vetrini per microscopia ottica e z-stack ricostruzione (Figura 1).
Per la preparazione di fettine di cervello abbiamo implementato un pezzo relativamente nuovo di strumenti chiamato 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Questo strumento è un semi-automatico microtomo dotato di un anticipo motorizzato e vibrazioni sistema blade con caratteristiche simili in funzione di vibratomes altri. A differenza di altri vibratomes, il tessuto da tagliare è montato in una spina agarosio all'interno di un cilindro di acciaio inox. Il tessuto viene estruso a spessori desiderati dal cilindro, e tagliare con la lama in avanti avanzando vibrante. La spina agarosio / sistema cilindro permette di tessuto riproducibile montaggio, allineamento e il taglio di precisione. Nelle nostre mani, il 'Compresstome' alte rese fette qualità dei tessuti per elettrofisiologia, immunoistochimica, e diretto fissa tessuto di montaggio e di imaging. In combinazione con compensazione ottica, qui abbiamo dimostrato la preparazione di semi-densi fettine di cervello fissata per imaging ad alta risoluzione fluorescenti.
Protocollo
1. Nella fissazione del cervello in situ
* Preparare una siringa da 10 ml (28 gauge) riempite con tampone fosfato (PBS).
* Preparare una siringa da 10 ml (28 gauge), riempito con il 4% paraformaldeide (PFA) in PBS. Riservare un ulteriore 5-10 ml di PFA / PBS per il fissaggio post.
- Iniettare intraperitoneale sperimentale del mouse con una dose letale di Avertin o Nembutal.
- Una volta che il mouse è sedato, bagnato l'addome con l'etanolo e sicuro il mouse fino al fondo di un vassoio a strati con sughero, cera, o elastomero di silicone con perni di dissezione. Con addome rivolto verso l'alto, sicuro....
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Discussione
Dato l'applicazione diffusa di utilizzare proteine fluorescenti a bersaglio sottoinsiemi neuronale per le indagini tramite microscopia ottica, la necessità di rapido dello schermo, l'immagine, e analizzare le reti neurali all'interno del tessuto cerebrale intatto è diventata insostituibile.
I progressi tecnici nello sviluppo di vettori virali user-friendly, nelle tecniche di elettroporazione in vivo, e ceppi di topi geneticamente modificati, offre ora.......
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Dichiarazioni
Jian-Qiang Kong è un dipendente di Precisionary Instruments, Inc., che produce un prodotto utilizzato in questo articolo.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato con il sostegno attraverso la Fondazione McNair, NARSAD e NINDS concedere R00NS064171-03.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome della voce | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Osso forbici | FST | 16044-10 | -O equivalente |
| Dissezione forbici | FST | 14084-08 | -O equivalente |
| Tipo IB agarosio | Sigma | A0576 | |
| Compresstome | Strumenti Precisionary | VF-200 | -Altri vibratomes sono compatibili |
| Biadesivo | Grace Bio-Labs | SA-S-1L | |
| Superfrost Inoltre diapositive | VWR | 48311-703 | |
| Copertura in vetro | VWR | 48383-139 | |
| Glicerolo | EMD Chemicals Inc. | GX0185-6 | -O equivalente |
Riferimenti
- Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. The Connectome Project. , (2009).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Micheva, K. D., Smith, S. J.
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Ristampe e permessi
