Идентификация и анализ Мышь прародителей эритроидных использованием CD71/TER119 Flow-цитометрии Пробирной
Summary
Блок-цитометрии метод для идентификации и молекулярного анализа дифференциации стадии конкретных мышиной предшественников эритроидных и прекурсоров, прямо в только что заготовленных мозга мыши костей, селезенки и печени плода. Анализ основывается на поверхности клеток маркеры CD71, Ter119 и размера ячейки.
Abstract
Исследования эритропоэза цели понять, как красный клетки образуются из более ранних гемопоэтических и эритроидных предшественников. В частности, скорость образования красных клетка регулирует гормон эритропоэтин (ЭПО), синтез которых вызывается тканевой гипоксии. Угроза на достаточное оксигенации тканей приводит к быстрому увеличению ЭПО, что привело к увеличению эритропоэза случае, процесс, известный как эритропоэтин реакцию на стресс. В результате увеличение количества циркулирующих эритроцитов улучшает доставку кислорода в тканях. Эффективное эритропоэтической стрессовой реакции является поэтому чрезвычайно важным для выживания и восстановления от физиологических и патологических состояний, таких как большой высоте, анемия, кровотечение, химиотерапии или трансплантации стволовых клеток.
Мышь ключевых модель для исследования эритропоэза и его стрессовую реакцию. Мышь окончательного (взрослый тип) эритропоэза происходит в печени плода между эмбриональными дней 12,5 и 15,5, в неонатальном селезенки и во взрослой селезенке и костном мозге. Классические методы определения эритроидных предшественников в ткани полагаются на способность этих клеток вызвать красные колонии клетка при посеве в Epo содержащих полутвердых СМИ. Их эритроидных предшественников потомства опознаются по морфологическим критериям. Ни один из этих классических методов обеспечения доступа к большому числу дифференциации стадии конкретных эритроидных клеток для молекулярных исследований. Здесь мы представляем потока цитометрии метод идентификации и изучения дифференциации стадии конкретных эритроидных предшественников и прекурсоров, непосредственно в контексте свежевыделенных мыши ткани. Анализ основывается на поверхности клеток маркеры CD71, Ter119, а на поток-цитометрии параметр "вперед рассеяния", которая является функцией от размера ячейки. CD71/Ter119 анализ может быть использован для изучения эритроидных предшественников во время их реакции на стресс эритропоэтической в естественных условиях, например, у анемичных мышей или мышей размещалась в условиях низкой кислорода. Он также может быть использован для изучения эритроидных предшественников непосредственно в тканях генетически модифицированных взрослых мышей или эмбрионов, с тем чтобы оценить специфическую роль изменение молекулярный путь в эритропоэза.
Protocol
Discussion
Потока цитометрии методология позволяет одновременно расследовании любых клеточных функций, которые могут быть обнаружены с помощью флуоресценции, конъюгированных специфические антитела или лиганд, в том числе на поверхности клеток маркеры, экспрессии белка, выживаемость клеток, к?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим UMass основной проточной цитометрии: Ричард Конц, Тед Giehl, Барбара Госселин, Yuehua Гу и Тэмми Krupoch. Эта работа финансировалась NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) и NIH CA T32-130807 (JRS). Основные ресурсы, поддерживаемые Диабет Эндокринологический научный центр грант DK32520 также были использованы.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Fas-biotin | BD Pharmingen | 554256 |
| Streptavidin-APC | Molecular Probes | S868 |
| 40 μm sterile cell strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Falcon | 352008 |
| U-bottom 96 well plate | BD Falcon | 353910 |
| ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 |
| DAPI powder | Roche | 236276 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 |
| FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 |
| APC BrdU Flow kit | BD Pharmingen | 557892 |
| Annexin V-biotin | BD Pharmingen | 556418 |
Riferimenti
- Liu, Y. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in. 108, 123-133 (2006).
- Socolovsky, M. Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis. PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).
- Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry. J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).
- Socolovsky, M. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98, 3261-3273 (2001).
- Guihard, S. The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis. Blood. 115, 3686-3694 (2010).
- Yu, X. An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis. J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).
- Chen, M. L. Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction. Blood. 114, 4045-4053 (2009).
- Chen, K. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Pop, R. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biol. 8, (2010).
- Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells. Nature. 196, 347-350 (1962).
