זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay
Summary
שיטה זרימה cytometric לזיהוי וניתוח מולקולרית של התמיינות בשלב ספציפי אבות Murine erythroid ומבשרי, ישירות במח שאך שנקטפו עכבר העצם, בטחול או בכבד העובר. Assay מסתמך על פני קרום התא הסמנים CD71, Ter119, וגודל התא.
Abstract
המחקר של erythropoiesis שמטרתו להבין כיצד תאים אדומים נוצרים אבות hematopoietic מוקדם erythroid. באופן ספציפי, קצב היווצרות תא אדום מווסתת על ידי ההורמון אריתרופויאטין (EPO), אשר מופעלת על ידי סינתזה היפוקסיה ברקמה. איום על תוצאות נאות חמצון הרקמות לעלייה מהירה Epo, נהיגה עלייה בשיעור erythropoietic, תהליך המכונה תגובת דחק erythropoietic. הגידול וכתוצאה מכך מספר מחזורי תאים אדומים משפר את אספקת החמצן לרקמות. התגובה היעילה מתח erythropoietic ולכן קריטי להישרדות והתאוששות ממצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים כגון בגובה רב, אנמיה, דימום, כימותרפיה או השתלת תא גזע.
העכבר הוא מודל מפתח לחקר erythropoiesis ואת תגובת הלחץ שלו. Erythropoiesis עכבר סופי (מבוגרים סוג) מתרחש בכבד העובר בין ימים עובריים 12.5 ו – 15.5, הטחול בילוד, ועל הטחול מבוגרים מוח העצם. שיטות קלאסיות של זיהוי אבות erythroid ברקמות לסמוך על יכולתם של תאים אלה כדי להצמיח מושבות תאים אדום כאשר מצופה ב Epo המכילים מוצקים למחצה בתקשורת. הצאצאים שלהם erythroid מבשר מזוהים על פי קריטריונים מורפולוגיים. אף אחת השיטות הקלאסיות לאפשר גישה למספר גדול של בידול בשלב ספציפי בתאי erythroid למחקר המולקולרי. כאן אנו מציגים שיטה זרימה cytometric לזהות וללמוד בידול בשלב ספציפי אבות erythroid ומבשרי, ישירות בהקשר של רקמות העכבר מבודדים טרי. Assay מסתמך על פני קרום התא הסמנים CD71, Ter119, ועל פרמטר זרימת cytometric "קדימה להתפזר", אשר הוא פונקציה של גודל התא. Assay CD71/Ter119 ניתן ללמוד אבות erythroid במהלך התגובה שלהם ללחץ erythropoietic in vivo, למשל, בעכברים או בעכברים אנמי שוכנו בתנאים חמצן נמוכה. זה עשוי לשמש גם כדי ללמוד אבות erythroid ישירות ברקמות של עוברי עכברים בוגרים או מהונדסים גנטית, כדי להעריך את התפקיד הספציפי של מסלול מולקולרי שונה ב erythropoiesis.
Protocol
Discussion
המתודולוגיה זרימה cytometric מאפשר חקירה סימולטני של כל פונקציה תאית עשויה להתגלות עם נוגדן פלואורסצנטי, מצומדות ליגנד ספציפי או, כולל משטח סמנים התא, ביטוי חלבון, הישרדות התא, מאותת לתא באמצעות נוגדנים ספציפיים phospho 3 מחזור מצב התא. מדידות אלה עשויים להיות בכל מספר ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים הליבה UMass cytometry זרימה: ריצ'רד Konz, טד Giehl, ברברה גוזלן, Yuehua גו ותמי Krupoch. עבודה זו מומנה על ידי NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) ו-NIH CA T32-130807 (JRS). משאבים Core נתמך על ידי לאנדוקרינולוגיה וסוכרת במרכז המחקר מענק DK32520 שימשו גם.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Fas-biotin | BD Pharmingen | 554256 |
| Streptavidin-APC | Molecular Probes | S868 |
| 40 μm sterile cell strainer | Fisherbrand | 22363547 |
| Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Falcon | 352008 |
| U-bottom 96 well plate | BD Falcon | 353910 |
| ChromePure Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 |
| DAPI powder | Roche | 236276 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 |
| FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 |
| FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 |
| APC BrdU Flow kit | BD Pharmingen | 557892 |
| Annexin V-biotin | BD Pharmingen | 556418 |
Riferimenti
- Liu, Y. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in. 108, 123-133 (2006).
- Socolovsky, M. Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis. PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).
- Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry. J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).
- Socolovsky, M. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98, 3261-3273 (2001).
- Guihard, S. The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis. Blood. 115, 3686-3694 (2010).
- Yu, X. An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis. J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).
- Chen, M. L. Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction. Blood. 114, 4045-4053 (2009).
- Chen, K. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Pop, R. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biol. 8, (2010).
- Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells. Nature. 196, 347-350 (1962).
