ניתוח כמותי של גרורות סרטן באמצעות דגם העובר העופות
Summary
באמצעות PCR כמותי, אנו מדגימים כיצד המודל ומבוססת חומוס CAM ניתן להשתמש כדי לנתח את כמותית גרורות של תאים סרטניים אנושיים לאיברים רחוקים.
Abstract
במהלך תאים סרטניים להפיץ גרורות מהגידול הראשוני, לפלוש לתוך הרקמות הסובבות, ומתפשטים לאיברים מרוחקים. גרורה היא תהליך מורכב זה יכול לערב סוגי רקמות רבות, בתקופות משך הזמן משתנה, ולעתים קרובות להתרחש עמוק בתוך איברים, ולכן קשה לחקור ולכמת. בנוסף, יעילות תהליך גרורתי מושפעת שלבים מרובים מפל גרורתית ולכן קשה להעריך את התרומה של היבט אחד של התנהגות תאים סרטניים. כתוצאה מכך, מבחני גרורות מבוצעות לעתים קרובות בחיות מעבדה לספק בהכרח בהקשר מציאותי שבו ללמוד גרורות. למרבה הצער, אלה הם מודלים מורכבים יותר על ידי הפיזיולוגיה המורכבת שלהם. עובר אפרוח הוא מודל ייחודי vivo כי מתגבר על מגבלות רבות ללימוד גרורות, בשל הנגישות של קרום chorioallantoic (רמ"א), היטב vascularized חוץ עובריים רקמות הממוקמת מתחת קליפת כי הוא פתוח xenografting של תאים סרטניים (איור 1). יתר על כן, מאז הוא עובר אפרוח immunodeficient טבעי, CAM בקלות תומך engraftment של רקמות הן נורמליות הגידול. והחשוב מכל, CAM העופות בהצלחה תומך המאפיינים תאים סרטניים ביותר כולל צמיחה, פלישה, אנגיוגנזה, שיפוץ של microenvironment. זה הופך את המודל שימושי במיוחד לצורך חקירה של מסלולים שיובילו גרורות סרטן כדי לחזות את התגובה של סרטן גרורתי כדי הרפוי פוטנציאליים חדשים. זיהוי של תאים המופץ על ידי מינים ספציפיים Alu PCR מאפשרת להעריך כמותית גרורות לאיברים כי הם יישבו על ידי כמה כמו 25 תאים. באמצעות קו קרצינומה האדם Epidermoid תא (HEp3) אנו משתמשים במודל זה כדי לנתח גרורות ספונטנית של תאים סרטניים לאיברים רחוקים, כולל הכבד חומוס ריאות. יתר על כן, באמצעות פרוטוקול Alu-PCR אנו מדגימים את רגישות שחזור של assay ככלי לניתוח לכמת, intravasation מעצר, extravasation, והקולוניזציה כמו אלמנטים בודדים של גרורות.
Protocol
Discussion
CAM חומוס שימש במשך עשרות שנים כמודל למערכת ללמוד היבטים שונים של הביולוגיה בסרטן גרורתי התקדמות. הערכה עקרון היכולות גרורתי בוצעו במודל זה על ידי מגוון של קבוצות, כולל ניתוח של תרדמת (אגירה Ghiso et al, 1999;. Ossowski ו רייך, 1983), שיפוץ רקמות (Deryugina et al, 2005;. האן-Dantona . et al,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו רוצים להכיר טייסון פודס בע"מ עבור בנדיבות לספק את הביציות המופרות. שארמה ארנולד סייעה במהלך הסרטה של פרוטוקול זה. Trenis פאלמר נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים תחת L. רות פרס Kirschstein הלאומית למחקר שירות (F31 המכון הלאומי לסרטן). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי CCSRI גרנט # 700537 כדי JDL NIH ו / NCI מענק # CA120711 ו-01A1-01A1 CA120711 ל AZ.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, VWR | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract–N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
Riferimenti
- Ghiso, A. g. u. i. r. r. e., Kovalski, J. A., K, ., Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. A model system for studying metastasis using the embryonic chick. Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).
- Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos. In Vivo. 4, 215-219 (1990).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).
- Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases. Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).
- Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat Med. 12, 354-360 (2006).
- Ossowski, L., Reich, E. Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment. Cell. 33, 323-333 (1983).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).
- Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis. Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).
- Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction. Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).
