تحليل الكمي الإنبثاث السرطان باستخدام الأجنة النموذجي الطيور
Summary
باستخدام كمية PCR ، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام نموذج راسخة CAM فرخ لتحليل كمي لورم خبيث من الخلايا السرطانية البشرية إلى الأجهزة البعيدة.
Abstract
خلال نشر الخلايا السرطانية الانبثاث من الورم الرئيسي ، إلى غزو الأنسجة المحيطة بها ، والانتشار إلى أعضاء بعيدة. الانبثاث هي عملية معقدة يمكن أن تنطوي على العديد من أنواع الأنسجة ، وفترات زمنية متنوعة ، وغالبا ما تحدث في أعماق الأجهزة ، مما يجعل من الصعب تحقيق وكميا. بالإضافة إلى ذلك ، تأثر فعالية عملية المتنقل بخطوات متعددة في تتالي النقيلي مما يجعل من الصعب تقييم مساهمة من جانب واحد للسلوك الخلية السرطانية. نتيجة لذلك ، كثيرا ما يتم تنفيذ المقايسات الانبثاث في حيوانات التجارب لتوفير سياق واقعي بالضرورة للدراسة الانبثاث. لسوء الحظ ، فإن تعقيد هذه النماذج التي لها علم وظائف الأعضاء المعقدة. الجنين الفرخ هو نموذج فريد في الجسم الحي أن يتغلب على الكثير من القيود على دراسة ورم خبيث ، ويرجع ذلك إلى سهولة الحصول على غشاء مشيمائي (CAM) ، وأوعية دموية جيدة خارج الأنسجة الجنينية تقع تحت قشر البيض الذي يتم تقبلا لxenografting الخلايا السرطانية (الشكل 1). وعلاوة على ذلك ، لأن الجنين الفرخ هو العوز المناعي بشكل طبيعي ، وتدعم CAM engraftment بسهولة من الأنسجة الطبيعية على حد سواء والورم. الأهم من ذلك ، CAM الطيور يدعم بنجاح خصائص الخلايا السرطانية أكثر بما في ذلك النمو ، والغزو ، الأوعية الدموية ، وإعادة تشكيل المكروية. هذا يجعل نموذج مفيد بشكل استثنائي من أجل التحقيق في الممرات التي تؤدي إلى ورم خبيث من السرطان والتنبؤ استجابة للعلاجات السرطان النقيلي جديدة محتملة. الكشف عن الخلايا التي تنشرها أنواع محددة PCR ألو يجعل من الممكن إجراء تقييم كمي لورم خبيث في الأجهزة التي استعمرها قليلة مثل 25 الخلايا. باستخدام الإنسان سرطانة بشرانية خط الخلية (HEp3) نستخدم هذا النموذج لتحليل الانبثاث عفوية الخلايا السرطانية إلى أعضاء بعيدة ، بما فيها الكبد والرئة الفرخ. علاوة على ذلك ، باستخدام بروتوكول ألو – PCR نظهر حساسية واستنساخ للمقايسة كأداة لتحليل وquantitate intravasation واعتقال والتسرب ، والاستعمار بوصفها عناصر فردية من ورم خبيث.
Protocol
Discussion
وقد استخدم CAM الفرخ على مدى عقود في نظام نموذجي لدراسة الجوانب المختلفة لتطور السرطان والبيولوجيا النقيلي. وقد تم تنفيذ مبدأ تقييم القدرات المنتشر في هذا النموذج من قبل مجموعة متنوعة من الفئات بما في ذلك تحليل السكون (Ghiso أغيري وآخرون ، 1999 ؛. Ossowski والرايخ ، 1983) ، إ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نريد أن يعترف تايسون فودز لتوفير بسخاء البويضات المخصبة. وكان ارنولد شانا مفيدة أثناء تصوير هذا البروتوكول. وأيد Trenis بالمر من قبل المعاهد الوطنية للصحة تحت L. روث الجائزة الوطنية كيرشتاين دائرة البحوث (F31 المعهد الوطني للسرطان). وأيد هذا العمل جزئيا من خلال المنح CCSRI # 700537 لرابطة الدفاع اليهودية والمعاهد الوطنية للصحة / NCI منح # CA120711 – 01A1 – 01A1 وCA120711 إلى الألف إلى الياء.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, VWR | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract–N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
Riferimenti
- Ghiso, A. g. u. i. r. r. e., Kovalski, J. A., K, ., Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. A model system for studying metastasis using the embryonic chick. Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).
- Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos. In Vivo. 4, 215-219 (1990).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).
- Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases. Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).
- Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat Med. 12, 354-360 (2006).
- Ossowski, L., Reich, E. Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment. Cell. 33, 323-333 (1983).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).
- Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis. Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).
- Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction. Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).
