Quantitative Analyse von Krebs Metastasen mit einem Vogelembryo Modell
Summary
Mit quantitative PCR, zeigen wir, wie die etablierten chick CAM-Modell verwendet werden, um quantitativ zu analysieren die Metastasierung von humanen Tumorzellen zu entfernten Organen sein.
Abstract
Während Metastasierung von Krebszellen aus dem Primärtumor zu verbreiten, in das umgebende Gewebe einzudringen, und die Ausbreitung auf entfernte Organe. Metastasierung ist ein komplexer Prozess, der viele Gewebetypen, span variable Zeiträume betreffen, können und treten oft tief in Organen, wodurch es schwierig zu untersuchen und zu quantifizieren. Darüber hinaus ist die Wirksamkeit des metastatischen Prozesses von mehreren Schritten in den metastatischen Kaskade macht es schwierig, den Beitrag eines einzelnen Aspekt der Tumorzelle Verhalten zu bewerten beeinflusst. Als Folge davon sind Metastasen Assays häufig in Versuchstieren durchgeführt, um eine unbedingt realistischen Kontext, in dem Metastasen Studie zur Verfügung. Leider sind diese Modelle durch ihre komplexen Physiologie kompliziert. Der Hühnerembryo ist ein einzigartiges In-vivo-Modell, das viele Beschränkungen überwindet, um das Studium Metastasierung, wegen der Erreichbarkeit der Chorioallantoismembran (CAM), einem gut durchbluteten extra-embryonalen Gewebe unter der Eierschale, die empfänglich für die xenografting von Tumorzellen befindet (Abbildung 1). Da darüber hinaus die Hühnerembryo natürlich immundefizienten ist die CAM leicht unterstützt die Transplantation von Normal-und Tumorgewebe. Am wichtigsten ist, die aviäre CAM erfolgreich unterstützt die meisten Krebszellen Eigenschaften wie Wachstum, Invasion, Angiogenese und Umbau der Mikroumgebung. Dies macht das Modell besonders nützlich für die Untersuchung der Signalwege, die zu Krebs Metastasen führen und die Reaktion von metastasierendem Krebs, neue potenzielle Therapeutika vorherzusagen. Der Nachweis von disseminierten Zellen durch artspezifische Alu-PCR ermöglicht die quantitative Erfassung Metastasen in Organen, die durch so wenig wie 25 Zellen besiedelt sind. Mit dem Human Epidermoidkarzinom Zelllinie (HEp3) verwenden wir dieses Modell zur spontanen Metastasierung von Krebszellen in entfernte Organe, wie das Küken Leber und Lunge zu analysieren. Zusätzlich hatte der Alu-PCR-Protokoll zeigen wir die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit des Tests als Instrument zur Analyse und Quantifizierung intravasation, Verhaftung, Extravasation und Kolonisierung als einzelne Elemente der Metastasierung.
Protocol
Discussion
Das Küken CAM ist seit Jahrzehnten als Modellsystem, um verschiedene Aspekte der Tumorbiologie und metastatischen Progression Studie verwendet. Prinzip Auswertung des metastasierten Fähigkeiten haben in diesem Modell wurde durch eine Vielzahl von Gruppen, einschließlich der Analyse der Vegetationsruhe durchgeführt (. Aguirre Ghiso et al, 1999; Ossowski und Reich, 1983), Gewebe-Remodeling (Deryugina et al, 2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999) und Metastasierung (Zijlstra et al, 2008;…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir wollen Tyson Foods Inc. für die großzügige Bereitstellung der befruchteten Eier zu erkennen. Shanna Arnold war während der Dreharbeiten zu diesem Protokoll instrumental. Trenis Palmer wurde von den National Institutes of Health unter der Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F31 National Cancer Institute) unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise durch CCSRI Grant # 700537 zur JDL und NIH / NCI gewähren # CA120711-01A1 und CA120711-01A1 auf AZ unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, VWR | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract–N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
Riferimenti
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