Kvantitativ analys av cancer metastaser med hjälp av en aviär Embryo Modell
Summary
Använda kvantitativ PCR, visar vi hur de väletablerade chick CAM-modell som kan användas för att kvantitativt analysera metastasering av humana tumörceller till avlägsna organ.
Abstract
Under metastaser cancerceller sprider sig från den primära tumören, invadera in i omgivande vävnader och sprida sig till avlägsna organ. Metastaser är en komplex process som kan innebära många vävnadstyper, span varierande tidsperioder, och förekommer ofta djupt inom organ, vilket gör det svårt att undersöka och kvantifiera. Dessutom är effekten av metastaserande process som påverkas av flera steg i metastaserande kaskad gör det svårt att utvärdera bidraget av en enda aspekt av tumörcellen beteende. Som en konsekvens är metastaser analyser som utförs ofta hos försöksdjur för att ge en nödvändighet realistiskt sammanhang där för att studera metastaser. Tyvärr är dessa modeller kompliceras ytterligare av deras komplexa fysiologi. Den kycklingembryo är en unik in vivo modell som övervinner många begränsningar att studera metastaser, på grund av tillgängligheten till chorioallantoic membran (CAM), ett väl vaskulariserad extra embryonal vävnad som finns under äggskal som är mottaglig för xenografting av tumörceller (figur 1). Eftersom den kycklingembryo är naturligt immunförsvar stöder CAM lätt att engraftment på både normala och tumörceller. Viktigast stöder aviär CAM framgångsrikt mest cancercellernas egenskaper, inklusive tillväxt, invasion, angiogenes och ombildningar av mikromiljö. Detta gör modellen exceptionellt användbar för utredning av vägar som leder till cancer metastasering och att förutsäga svaret av metastaserande cancer till nya potentiella läkemedel. Upptäckten av sprids celler genom artspecifika Alu PCR är det möjligt att kvantitativt bedöma metastaser i organ som är koloniserade av så få som 25 celler. Använda Human epidermoid Carcinom cellinje (HEp3) vi använda denna modell för att analysera spontana metastasering av cancerceller till avlägsna organ, inklusive ungen lever och lunga. Dessutom använder Alu-PCR-protokoll vi visar den känslighet och reproducerbarhet analysen som ett verktyg för att analysera och kvantifiera intravasation, gripande, extravasering, och kolonisering som enskilda delar av metastaser.
Protocol
Discussion
Den unge CAM har använts i årtionden som modellsystem för att studera olika aspekter av cancer biologi och metastaserande progression. Princip utvärdering av metastaserande förmågor har gjorts i denna modell av en mängd olika grupper, inklusive en analys av dvala (Aguirre Ghiso et al, 1999;. Ossowski och Reich, 1983), vävnad ombyggnad Deryugina et al (2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999) och metastaser (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra et al, 2002).. Det fortsätter att …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill känna igen Tyson Foods Inc. för generöst att ge de befruktade äggen. Shanna Arnold var avgörande under inspelningen av detta protokoll. Trenis Palmer stöddes av National Institutes of Health enligt Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (F31 National Cancer Institute). Detta arbete har delvis stöd av CCSRI Grant # 700.537 till JDL och NIH / GNI bevilja # CA120711-01A1 och CA120711-01A1 till AZ.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 1X Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X), liquid | Invitrogen | 14190250 | pH 7.4 |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300054 | |
| Sportsman hatcher | Berry Hill | 1550HA | These incubators are some of the most readily available. However, the video will show different equipment. |
| Sportsman incubator | Berry Hill | 1502EA | |
| Dremel rotary tool | Dremel | ||
| Dremel cutoff wheels no. 36 | Dremel | 409 | |
| Portable Pipette Aid | Fisher | 1368115E | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 23-400-001) | |
| Fertilized Eggs | Various | Many different vendor can be used. The eggs should be approximately 35-55 grams. The hens that lays them should be between 36 and 55 weeks of age. | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific, VWR | 15170-090 | |
| Fiber-optic microscope illuminator | Amscope | HL250-AY | 150W |
| 25 gauge needle | |||
| Sybr Green Extract–N-Amp Tissue PCR Kit | Sigma-Aldrich | XNATRG |
Riferimenti
- Ghiso, A. g. u. i. r. r. e., Kovalski, J. A., K, ., Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. A model system for studying metastasis using the embryonic chick. Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).
- Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos. In Vivo. 4, 215-219 (1990).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).
- Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases. Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).
- Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat Med. 12, 354-360 (2006).
- Ossowski, L., Reich, E. Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment. Cell. 33, 323-333 (1983).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).
- Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis. Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).
- Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction. Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).
