Cost-effektiv metode til Microbial Source Tracking bruge specifikke menneskers og dyrs Vira
Summary
Undersøgelsen beskriver en cost-effektiv metode til identifikation af kilden til fækal / urin forurening eller forurening med nitrater i vand ved hjælp qPCR for den specifikke kvantificering af human / svin / kvæg DNA virus, adenovirus og polyomaviruses, foreslået som MST værktøjer.
Abstract
Mikrobiel forurening af miljøet udgør en betydelig sundhedsrisiko. Klassisk bakteriel fecal indikatorer har vist sig at have væsentlige begrænsninger, vira er mere modstandsdygtige over for mange inaktivering processer og standard fækal indikatorer ikke informere om kilden til forureningen. Udvikling af omkostningseffektive metoder til koncentration af virus fra vand og molekylære assays letter anvendeligheden af vira som indikatorer for fækal forurening og som mikrobiel kildesporing (MST) værktøjer. Adenovirus og polyomaviruses er DNA-virus inficerer specifikke hvirveldyr arter, herunder mennesker og er vedvarende udskilles i afføring og / eller urin i alle geografiske undersøgte områder. I tidligere undersøgelser, foreslog vi kvantificering af menneskelige adenovirus (HAdV) og JC polyomaviruses (JCPyV) ved kvantitativ PCR (qPCR) som et indeks over menneskelig fækal forurening. For nylig har vi udviklet qPCR assays for den specifikke kvantificering af porCine adenovirus (PAdV) og bovin polyomaviruses (BPyV) som dyr fecal markører for forurening med følsomheder på 1-10 genom kopier pr reagensglas. I denne undersøgelse præsenterer vi den procedure, der skal følges for at identificere kilden til forurening i vandprøver ved hjælp af disse værktøjer. Som eksempel på repræsentative resultater, er en analyse af virus i grundvand præsentere højt indhold af nitrat vist.
Påvisning af virus i lav eller moderat forurenet vand kræver, at koncentrationen af virus fra mindst flere liter vand i en meget mindre volumen, en procedure, der normalt omfatter to koncentrering i serie. Denne noget besværlige procedure og variation hos viral inddrivelser betydeligt hæmmer samtidig behandling af et stort antal vandprøver.
For at fjerne den flaskehals er forårsaget af de to trin procedurer, vi har anvendt en et-trins protokol udviklet i tidligere studies og som gælder for en mangfoldighed af vand matricer. Proceduren omfatter: forsuring af ti-liters vandprøver, flokkulering af skummetmælk, tyngdekraften sedimentering af flocculated materialer, indsamling af bundfaldet og centrifugering, resuspension af bundfaldet i 10 ml fosfatbuffer. Den virale koncentrat bruges til udvinding af virale nukleinsyrer og de specifikke adenovirus og polyomaviruses af interesse er kvantificeret ved qPCR. Stort antal prøver kan samtidig analyseres ved denne billige koncentration metode.
Den procedure er blevet anvendt til analyse af badevand, havvand og flodvand, og i denne undersøgelse, præsenterer vi resultaterne analysere grundvand prøver. Denne high-throughput kvantitative metode er pålidelig, ligetil, og omkostningseffektiv.
Protocol
Discussion
Den beskrevne procedure ville opfylde betingelserne for en passende metode til rutinemæssig miljø og folkesundhed laboratorier: reproducerbare, pålidelige, enkle og omkostningseffektive. Protokollen er simpel, men det skal følges nøje. Lav ledningsevne i prøverne uden at tilføje den ønskede koncentration af kunstigt havvand salte vil dramatisk reducere inddrivelse af vira som ville være tilfældet, hvis omrøring tid til flokkulering væsentligt reduceret (mindre end 5 timer for eksempel).
<p class="j…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af den spanske regering "Ministerio de Educación y Ciencia" (projekt AGL2008-05275-C01/ALI), af Den Europæiske Union forskningsrammeprogram 7 støttede projekter VIROBATHE (Kontrakt nr. 513648), VIROCLIME (Kontrakt nr. 243923 ) og af det catalanske agentur for Vand, Agencia Catalana de l'Aigua (ACA), Departament de Control I Millora Dels Ecosistemes Aquatics. I løbet af de udviklede studiet Marta Rusinol var en fyr i den catalanske regering "AGAUR" (FI-DGR).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| High speed centrifuge (8,000xg) | Berckman Coulter | Avanti J-20XP | |
| pH-meter, thermometer and conductimeter | Afora | LPPC3003 | |
| Plastic tubes 100-200 cm length | Deltalab | 350059 | |
| Sterile graduated disposable pipettes | Labclinics | PN10E1 | |
| Sterile plastic tubes of 1.5 and 10-15 mL (Eppendorf, Falcons, etc.) | Afora | KA298/00 | |
| Centrifuge pots (500 mL) | Fisher Scientific | SE5753512 | |
| Magnetic stirrers and magnets (one per sample) | Fisher Scientific | 10510 | |
| Glass or plastic containers having flat bottoms to allow the use of magnetic stirrers | Deltalab | 191642 | |
| A peristaltic pump for removing the supernatant (or a water-jet vacuum pump) | Watson-Marlow | 323E/D | |
| Timer to switch-off the stirring after 8-10 hours | Deltalab | 900400 | |
| Hydrochloric acid (1N and 0.1N) | Panreac | 141020.1611 | |
| Sodium hydroxide (1N) | Panreac | 131687.1211 | |
| Artificial seawater sea salts | Sigma | S9883 | |
| Skimmed milk (SM) | Difco | 232100 | |
| Phosphate buffer pH 7,5 | 1:2 v/v of sterile Na2HPO4 0,2M and NaH2PO4 0,2M at pH 7.5 | ||
| Thiosulphate | Panreac | 121879.1209 | Make a 10% solution in water |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| 96-well optical reaction plate (500 units) | Applied Biosystems | 43426659 | |
| Optical adhesive covers (100 units) | Applied Biosystems | 4311971 | |
| TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x | Applied Biosystems | 4396838 |
Riferimenti
- Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission. J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).
- Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).
- Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M, ., Girones, R. Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool. J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E, ., Girones, R. Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment. J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).
- Hundesa, A., de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N, ., Girones, R. Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).
- Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR. J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).
- de Motes, M. a. l. u. q. u. e. r., Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination. Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).
- Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses. J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).
- Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. a. v. i. e. s., Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J, ., Gawler, A. Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water. Water Res. 43, 4888-4899 (2010).
- Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand. N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).
