تسلسل الدقيقة البكتيرية في الدم المحيطي : لدينا تجربة مع المرضى المصابين بفيروس الإيدز
Summary
وتجربتنا تبين كيفية إجراء تحليل تسلسل الأنواع البكتيرية translocating في الدم المحيطي من المرضى بفيروس نقص المناعة البشرية.
Abstract
وفيزيولوجيا الجهاز الهضمي صحي مستعمرة من قبل مجموعة كبيرة ومتنوعة من الجراثيم المتعايشة التي تؤثر على تطور الخلطية والخلوية المخاطية 1،2 الجهاز المناعي.
محمية مجهريات البقعة من الجهاز المناعي عن طريق حاجز الغشاء المخاطي قوية. ومن المعروف الالتهابات والمضادات الحيوية لتغيير كل من الحاجز الطبيعي القناة الهضمية وتكوين البكتيريا المقيمين ، والتي قد تؤدي إلى تشوهات المناعي ممكن 3.
فيروس يسبب ثغرة في جدار المعدة والأمعاء مع الفشل التدريجي للحصانة والتسرب إلى الدورة الدموية الجهازية من المنتجات الحيوية البكتيرية ، مثل lipopolysaccharide وشظايا من الحمض النووي البكتيري ، والتي تساهم في تنشيط جهاز المناعة النظامية 4-7. متورط إزفاء الميكروبية في فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز إمراض مناعي واستجابة للعلاج 4،8.
نحن تهدف إلى تميز تكوين البكتيريا في الدم المحيطي translocating من المرضى المصابين بفيروس الإيدز. لمتابعة هدفنا أنشأنا تفاعل PCR لجين 16S panbacteric ribosomial تليها تحليل التسلسل.
باختصار ، يتم استخدام الدم الكامل من كلا الموضوعين المصابين بفيروس الإيدز وصحية. نظرا إلى أن الأفراد الأصحاء الحاضر توازن الأمعاء الطبيعي أنه لا يتوقع من إزفاء الدقيقة في هؤلاء المرضى. التالية كلها جمع الدم عن طريق بزل الوريد وفصل البلازما ، ويتم استخراج الحمض النووي من البلازما وتستخدم لتنفيذ عملية واسعة النطاق تفاعل PCR ل16S panbacteric ribosomial الجين 9. تتم تنقية المنتجات التالية PCR ، والاستنساخ وتسلسل التحليلات.
Protocol
Discussion
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للمساعدة Scimone جياني ممتازة مع صناعة الفيديو.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Easty-DNA Kit | Invitrogen | K 180001 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7203 | |
| UltraPure Waer | Invitrogen | 10977049 | |
| Lysozyme | Fluka | 62970 | 10 μg/mL in Distillated Water |
| AmpliTaq Gold | Applied Biosystem | 26478701 | |
| Microcon 100 | Millipore | 42413 | |
| PCR primers | Invitrogen | ||
| Agarose | Eppendorf | C1343 | |
| DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| Purelink PCR micro kit | Invitrogen | K310050 | |
| LB Agar, powder | Invitrogen | 22700025 | |
| Bactoagar | Invitrogen | ||
| Ampicillin | Invitrogen | 11593027 | 10 mg/mL in Distillated Water |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | 40mg/mL in DMF |
| IPTG | Invitrogen | 15529019 | 100mM in Distillated water |
| Topo TA cloning kit | Invitrogen | K450002 | |
| Purelink Quick Plasmid Miniprep kit | Invitrogen | K210010 | |
| Big dye | Applied Biosystem | 4337455 | |
| DyeEx 2.0 spin kit | Qiagen | 63204 |
Riferimenti
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).
- Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).
- Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease. Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).
- Brenchley, J. M. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).
- Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe. Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).
- Jiang, W. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).
- Marchetti, G. Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy. AIDS. 22, 2035-2038 (2008).
- Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. , (2010).
- Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).
