Transplantation av mus neurala stamceller (NSCs) i ryggmärgen hos möss med etablerade demyelinisering är detaljerad. Beredningen av NSCs är laminektomi av bröstkotan 9 (T9) och transplantation av NSCs beskrivs tillsammans med pre-och postoperativa vården av möss.
Möss infekterade med neurotrop JHM stam av mus hepatit virus (MHV) utveckla patologiska och kliniska resultat liknar patienter med demyeliniserande sjukdom multipel skleros (MS). Vi har visat att transplantation av NSCs in i ryggmärgen av sjuka möss leder till en signifikant förbättring i både remyelination och kliniskt utfall. Cell ersättare terapier för behandling av kroniska neurologiska sjukdomar är nu en realitet och in vivo-modeller är viktiga för att förstå samspelet mellan engrafted celler och värdvävnaden mikromiljö. Denna presentation ger en anpassad metod för att transplantera celler in i ryggmärgen av JHMV-infekterade möss. I korthet erbjuder vi ett förfarande för att i) utarbetande av NSCs före transplantationen, ii) pre-operativ vård av möss, iii) exponering av ryggmärgen via laminektomi, iv) stereotaktisk injektion av NSCs, och iv) postoperativ vård .
En väl genomförd transplantation blir beroende främst på den noggranna laminektomi och injektion av cellerna. Den främsta fallgropen att undvika vid ett laminektomi är skadligt för ryggmärgen. Detta kan inträffa under förfarandet självt eller av skador orsakade av vassa benfragment kvar efter förfarandet. För att undvika dessa, se till att punkterna i den böjda mikro saxen alltid är vända bort från sladden och noga undersöka laminectomized ryggraden att säkerställa att alla benfragment tas bort och att resterande ryggraden strukturen inte har öppet utskjutande eller ojämna kanter.
Som tidigare nämnts, kommer att upptäcka utflödet vara möjligt om ljuset skiner starkt och direkt på den exponerade ryggmärgen under injektionen. Efflux är mest sannolikt att hända med 30 gauge nålar (jämfört med 33 gauge) och om injektionen sker för snabbt. Även om detta protokoll har gett oss goda resultat, men andra har meddelat längre väntetider (upp till 5 minuter) innan återgång nålen efter injektion 8,9. Även mindre gauge nålar är att föredra, men vi har konstaterat att vissa celler är för lätt lyseras då passerade 33 gauge nålar.
För att maximera effektiviteten, är en transplantation laget bemannar fyra olika stationer (mus prep, laminektomi, injektion, och suturer) önskvärt. Dessutom bör tidpunkten för varje förfarande optimeras för att minimera tiden cellerna väntar på is. Till exempel, vi transplantationen våra möss i grupper om fyra (antalet doser i varje last av sprutan), börjar personen injicera cellerna lastning sprutan efter den tredje musen har laminectomized och den person som färdigställt möss bör söva följande gruppen efter den andra musen av den tidigare gruppen har varit laminectomized. På detta sätt kan vi transplantera celler (eller kontrollera media) till 40 möss i cirka 3 timmar, även om var och mus tar ca 30-40 min.
Cell ersättare terapier för behandling av vissa sjukdomar i centrala nervsystemet finns för närvarande i kliniska prövningar 10. Det finns ingen ersättning för in vivo-modeller av NSC transplantation och våra protokoll för engraftment av NSCs in i ryggmärgen av möss med virus-inducerad demyelinisering underlättar användningen av en viktig modell av MS och kan enkelt anpassas till andra modeller.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Ketaject | Phoenix Parmaceuticals | NDC 57319-542-02 | |
Xylazine Hydrochloride | MP Biomedicals | 158307 | |
Nair | Church & Dwight Co. | ||
10μl Hamilton Syringe w/ Removable needle | Hamilton Company | 7635-01 | |
Hamilton Needles, 30G or 33 G, ½ inch, 30° bevel | Hamilton Company | 7803-077803-05 | Test the viability of your cells following passage through needles to identify the best gauge to use |
Micro Scissors | World Precision Instruments | 555500S | |
Small Graefe Forceps | FST | 11053-10 | |
Stereotaxic | KOPF Instruments | Model 1772 Universal Holder | |
Stereotaxic | KOPF Instruments | Model 1773 Electrode Holder | |
Stereotaxic | KOPF Instruments | Model 902 small animal stereotaxic | |
Stereotaxic | KOPF Instruments | Model 960 left electrode carrier | |
Sutures | Ethicon | 95057-064 | |
Lactated Ringers | Hospira | NDC 0409-7953-03 | |
Staples | Fine Science | 12032-07 | |
Hemostat | FST | 13010-12 | |
Scalpels, sizes 10,11 | Fisher | 268878, 268879 | |
Sutures | ETHICON | 1676G | size 5-0, 3/8″ circle, 19mm needle, 45cm braided thread |
Reflex 7 wound clip applicator | FST | 12031-07 | |
7mm Reflex wound clips | FST | 12032-07 | |
Olsen-Hegar needle holder | FST | 12502-12 |