Gerichte Training van Ultrasone Spreken in Aged en Parkinson ratten

Summary

Stemstoornissen zijn slopende in veroudering en de ziekte van Parkinson. De ultrasone geluiden van ratten, ook beïnvloed door deze omstandigheden kan worden gebruikt om deze stemstoornissen, hun neurale substraten, en de aard van functioneel herstel met gedrags-interventie studie.

Abstract

Voice tekorten zijn een veel voorkomende complicatie van zowel ziekte van Parkinson (PD) en de vergrijzing, ze kunnen de kwaliteit van leven aanzienlijk verminderen door invloed communicatie vaardigheden ^{1, 2} Gerichte training (spraak / stem therapie) kan verbeteren specifieke stem tekort, ^{3, 4} hoewel de. onderliggende mechanismen van gedragsinterventies worden niet goed begrepen. Systematisch onderzoek van de stem tekorten en de behandeling zou moeten overwegen vele factoren die moeilijk te controleren bij de mens, zoals leeftijd, woonomgeving, leeftijd na begin van de ziekte, de ernst van de ziekte en medicatie. De methode die hier maakt gebruik van een diermodel van vocalisatie die het mogelijk maakt voor de systematische studie van hoe de onderliggende sensorimotorische mechanismen te veranderen met gerichte stemtraining. De ultrasone registratie en analyse procedures beschreven in dit protocol zijn van toepassing op een onderzoek naar knaagdier ultrasone geluiden.

De ultrasone geluiden van het knaagdieren zijn in opkomst als een waardevol model om de neurale substraten van het gedrag te onderzoeken. ^5-8 Zowel knaagdier-en menselijke geluiden dragen semiotische waarde en worden geproduceerd door het wijzigen van een egressive luchtstroom met een larynx vernauwing. Aldus ^{9, 10,} knaagdier vocalisaties kan een bruikbaar model om voice tekorten studie in een sensorimotorische context. Verder, rat modellen stellen ons in staat om de neurobiologische onderbouwing van herstel studie van tekorten met gerichte training.

Voor het modelleren van PD gebruiken wij Long-Evans ratten (Charles River Laboratories International, Inc) en induceren parkinsonisme door een eenzijdige infusie van 7 microgram van 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in de mediale voorhersenen bundel waardoor een matige tot ernstige degeneratie van presynaptische striatum neuronen (zie voor details Ciucci, 2010). ^{11, 12} Voor onze vergrijzende model gebruiken we de Fischer 344/Brown Noorwegen F1 (National Institute on Aging).

Onze primaire methode voor het uitlokken van geluiden is om seksueel ervaren mannelijke ratten bloot aan seksueel ontvankelijk vrouwelijke ratten. Wanneer het mannetje raakt geïnteresseerd in de vrouw, is de vrouwelijke verwijderd en de man blijft vocalize aan. Door hen te belonen complexe geluiden met voedsel of water, zowel het aantal complexe geluiden en de snelheid van vocalisaties kan verhoogd worden (Figuur 1).

Een ultrasone microfoon gemonteerd boven huis van de man Cage Records het stemgebruik. De opname begint na de vrouwelijke rat is verwijderd om de mannelijke gesprekken te isoleren. Geluiden kunnen worden bekeken in real time voor een opleiding of geregistreerd en geanalyseerd offline. Door het opnemen van geluiden en akoestisch te analyseren voor en na de vocale training, kunnen de effecten van ziekte en herstel van de normale functie met opleiding worden beoordeeld. Dit model maakt het ook mogelijk dat we de waargenomen gedrag (zang) verbeteringen hebben betrekking op veranderingen in de hersenen en het neuromusculaire systeem.

Protocol

1. Pre / Post-training Recordings

1. Begin ultrasone monitoring met Avisoft Recorder met behulp van de configuratie weergegeven in figuur 2.
2. Ultrasone geluiden kunnen visueel worden gecontroleerd, hetzij door te kijken naar de real-time spectrogram, of auditief met een hoofdtelefoon aangesloten op de echo-opname interface.
3. Plaats een seksueel ontvankelijk (in oestrus) vrouwelijke rat in de kooi van het onderwerp mannelijke rat. Tekenen van oestrus zijn lordose, oor wiebelen, en snelle schoten. Vrouwen in estrus ontlokken meer geluiden van de mannetjes dan bij niet-seksueel ontvankelijk vrouwtjes.
4. Nadat het mannetje heeft interesse getoond in de vrouwelijke (bijv., snuiven, jagen, en / of montage), verwijder de vrouwelijke en registreren van de man stemgebruik voor 1-2 minuten.
5. Als de man niet onmiddellijk vocalize, even terug te keren bij de vrouwelijke rat naar huis van de man kooi om vocalisatie te stimuleren.

2. Vocal Training

1. Begin ultrasone monitoring met Avisoft Recorder met dezelfde configuratie weergegeven in figuur 2.
2. Plaats de mannelijke rat in zijn kooi onder de microfoon.
3. Doe een vrouwelijke rat in het huis van de man kooi. Zoals eerder vermeld, moet de vrouwelijke rat in estrus aan de vocalisatie reactie van de man te maximaliseren.
4. Zodra het mannetje heeft interesse getoond in de vrouwelijke verwijder de vrouw.
5. Onmiddellijk na de mannelijke het doel stemgeluid produceert, tegelijk belonen met een pen te klikken en een korte presentatie van het water fles of voedsel te behandelen. In eerste instantie is een 50-kHz frequentie gemoduleerd (Figuur 5B) noemen beloond. Als opleiding vordert alleen steeds complexer snaren van gesprekken, zoals de snaren van 5 tot 10 gesprekken in snelle opeenvolging, worden versterkt.
6. Ga door met de training tot u hebt gegeven 30 versterkingen. Dit duurt meestal tussen de 5 - 10 minuten.

3. Voorbereiding voor akoestische analyse

1. Altijd het archief van de originele geluidsbestanden te maken en bewerkingen en metingen op een werkkopie, omdat de analyse vereist filtering en wissen van het geluid van elk bestand.
2. Met behulp van de batch mode van Avisoft SASLab Pro, high pass filter alle geluidsbestanden te analyseren bij 25 kHz tot ongewenste ruis onder de ultrasone geluiden te verwijderen.
3. Om de automatische detectie van SASLab Pro gebruiken, moet het lawaai drempel eerst worden bepaald. Om dit te doen, opent u een geluidsbestand en maak een spectrogram met de instellingen weergegeven in Figuur 3.
4. De Automatische parameter metingen weer te geven moet worden ingesteld volgens de instellingen weergegeven in Figuur 4.
5. Zoek een gedeelte van het spectrogram waar er geen gesprekken of geluiden, dit is het achtergrondgeluid.
6. Met behulp van de "automatische (enkele drempel)" optie, stelt u de drempel in de Element scheiding deel van de Automatische parameter metingen dialoogvenster voor het instellen tot net boven het achtergrondgeluid door het aanpassen van de zwarte lijn in de kracht spectrum raam boven het spectrogram. In figuur 4 is de drempel is ingesteld op -55 dB.
7. Aan de onderkant van het dialoogvenster stelt u de "Weigeren als piek amplitude is kleiner dan" waarde naar 1 dB onder de drempel in de vorige stap. Deze twee waarden moet nu worden gebruikt voor alle geanalyseerde geluidsbestanden, ervan uitgaande dat alle opname-instellingen hetzelfde waren.

4. Vocalisatie Identificatie

1. Te labelen het stemgebruik met behulp van de automatische drempel waarboven set, maakt u eerst een spectrogram met de bovenstaande instellingen.
2. Handmatig gewist lawaai dat voldoet aan de volgende criteria: 1) ten onrechte geïdentificeerd als een vocalisatie, 2) van invloed is op de discriminatie van het begin en / of einde van de vocalisatie en / of 3) is ten onrechte geïdentificeerd als de hoogste of laagste frequentie in de vocalisatie (aangegeven door de bovenste en onderste rode lijnen, respectievelijk). Als alternatief kan de start / stop tijden van de vocalisatie labels handmatig worden aangepast na het maken van een permanente labels in stap 4.5 hieronder. Ruis die de hoge en lage frequentie metingen echter handmatig moet worden gewist.
3. In sommige gevallen is een vocalization zal niet kunnen worden gescheiden van de omringende geluiden, zoals het geluid van beddengoed gedurende beweging. In deze gevallen kan de oproep niet nauwkeurig worden geanalyseerd en moeten worden gewist.
4. Zodra alle geluiden zijn geïdentificeerd, permanent de verwijderde delen van het spectrogram te wissen uit het geluidsbestand door het selecteren van "Remove gewist spectrogram secties van golfvorm ..." uit het Tools drop-down menu. Als deze opdracht is niet uitgevoerd voordat de spectrogram is gesloten, zullen alle wissen werk verloren gaan.
5. Maak een permanente labels in het geluidsbestand door te klikken op de 'edit' knop in de Element Scheiding deel van de Automatische parameter metingen setup venster.
6. Visueel en auditief beoordelen elk gelabeld vocalisatie om de categorie te bepalen: eenvoudige, frequentie gemoduleerd (FM), of harmonische. Ezelign het juiste label met behulp van de vooraf gedefinieerde tekst-modules. Voorbeelden van elke vocalisatie categorie zijn weergegeven in figuur 5.
7. Sluit het spectrogram, slaat u het geluidsbestand, en verder met de volgende geluidsbestand dat moet worden geanalyseerd.

5. Akoestische metingen

1. Na de geluiden in alle geluidsbestanden zijn geïdentificeerd, gebruik maken van de batch processing tool (Tools: Batch Processing) om automatisch het meten van de akoestische parameters van alle bestanden.
2. In de batch processing dialoogvenster, selecteert u "Automatisch Parameter Afmetingen" uit het drop-down menu.
3. Selecteer het "proces alle bestanden in de geselecteerde map" checkbox klik vervolgens op de "folder" knop en selecteer de map waar de geluidsbestanden worden opgeslagen.
4. Klik op "Start" en elk bestand zal automatisch worden geanalyseerd volgens de instellingen die het laatst gebruikt in de automatische Parameter meetopstelling dialoogvenster.
5. De metingen zullen worden opgeslagen in een tekst bestand dat kan worden gedefinieerd met behulp van de DDE Parameters / Log File-instelling commando. Deze tekst bestand kan vervolgens worden geïmporteerd in een programma voor statistische analyse.

6. Representatieve resultaten:

Ultrasone geluiden van ratten worden beïnvloed door fysiologische veranderingen die gepaard gaan met het ouder worden en 6-OHDA de ziekte van Parkinson modellen ¹³ Typisch, we zien een vermindering van de kwaliteit van de ultrasone geluiden gekenmerkt door een vermindering van de volgende kwantitatieve akoestische parameters:. Bandbreedte, piek frequentie, duur , en intensiteit. Figuur 6 toont de frequentie gemoduleerde stemgebruik van een rat in de PD-model op drie verschillende tijdstippen: baseline, na inductie van de PD, en na de vocalisatie training. In de PD staat, wordt het gesprek toont een vermindering van de bandbreedte, de duur en intensiteit. Daarnaast is de frequentie modulatie onregelmatig.

Naast een achteruitgang van specifieke akoestische parameters, hebben we ook waarnemen minder algemene complexiteit in de aard van de geluiden geproduceerd in de leeftijd en parkinsonisme ratten. Bijvoorbeeld na inductie van PD een rat produceert een groter aantal eenvoudige gesprekken en minder frequentiegemoduleerde oproepen. Na de vocalisatie training, veel akoestische parameters, zoals de duur en intensiteit, aanpak baseline niveaus en het aantal complexe gesprekken toeneemt (Figuur 6). Oude ratten manifesteren soortgelijke afbraak van akoestische parameters in hun ultrasone geluiden. We zijn momenteel onderzoek naar de effecten van de vocale training in oude ratten.

Figuur 1. Aantal vocalisaties per sessie (doel bereikt door alle ratten per week) en vocalisatie snelheid (gemiddelde en standaard fout weergegeven) zowel de stijging ten opzichte van een 6-week stage in een groep van zowel jonge (9 mo) en oude (32 MO) Fischer 344/Brown Noorwegen F1 ratten.

Figuur 2 Vertegenwoordiger geluiden van elk van de drie categorieën van 50 kHz vocalisaties;. (A) eenvoudig, (B) frequentie-gemoduleerd, en (C) harmonische.

Figuur 3. Vertegenwoordiger frequentiegemoduleerde geluiden van een enkele rat bij (A) baseline, (B) post-PD inductie, en (C) na vocalisatie training.

Discussion

Ultrasone vocalisaties bij ratten blijken kwetsbaar voor veroudering en ziekte-processen, zoals de ziekte van Parkinson. Deze ultrasone geluiden zorgen voor een gedragsmodel van vocale functie, met inbegrip van tekorten die fysiologische veranderingen als gevolg van ziekte en veroudering te begeleiden. Daarnaast zijn akoestische veranderingen in de ultrasone geluiden gemakkelijk gemeten en gekwantificeerd. Verder kunnen ultrasone geluiden worden gewijzigd door middel van gedragsinterventies. Daarom, rat ultrasone geluiden zorgen voor een bruikbaar model om de invloed van ziekte te bestuderen, veroudering, en therapeutische interventies op zowel het gedrag en de onderliggende neurobiologische mechanismen.

Onze methode van vocale opleiding maakt gebruik van een geconditioneerde stimulus (een klik) geassocieerd met een positieve versterking (een water of voedsel te behandelen beloning). De klik, gevolgd door de beloning wordt gebruikt om de geluiden van toenemende complexiteit te versterken. We definiëren complexe geluiden als die met een "triller" (frequentie gemoduleerd) component (Figuur 5B) versus degenen die "plat" en onderhouden van een enkele frequentie (figuur 5A). Deze frequentie gemoduleerde component is gemakkelijk te herkennen door zijn sinusvormige uiterlijk. Terwijl de 50-kHz geluiden zijn volledig sinusvormig (Figuur 5B), is het gebruikelijk om ontmoeting meer complexe 50-kHz vocalisaties die bestaan ​​uit een deel van deze frequentie gemoduleerd component als een grote sprongen in frequentie of een korte vlakke component. Deze meer complexe geluiden kunnen hebben korte onderbrekingen van minder dan 10 ms tussen de componenten, maar worden beschouwd als een vocalisatie. Hoewel de verdere gedetailleerde sub-classificatie van deze geluiden is het mogelijk offline, ¹⁴ classificeren we alle 50-kHz geluiden met een frequentie gemoduleerd component als complex aan de behoefte aan online subjectieve indeling te verminderen en te verminderen versterking variabiliteit. In uw eigen lab is het belangrijk om te kiezen hoe gegevens worden geclassificeerd en geanalyseerd volgens een studie ontwerp dat geschikt is voor het doel van het onderzoek.

Er zijn veel factoren te overwegen bij het gebruik van dit protocol. In de eerste plaats, ondanks de genetische homogeniteit en procedurele consistentie, ratten hebben een variabele respons op training. Sommige ratten van nature vocalize meer dan anderen, ⁵ of worden gemotiveerd door de blootstelling aan een vrouwelijke meer dan een voedsel of water te belonen. Een manier waarop we rekening voor deze variabiliteit is door onderzoek van de verandering in de akoestische parameters van de individuele ratten 'baseline geluiden om hun post-laesie en post-training vocalisaties. Hoewel het niet besproken in dit protocol, hebben we ook gedrags-assays te interesseren in de vrouwelijke, zoals de latency te monteren kwantificeren. Bovendien, afhankelijk van de leeftijd en de activiteit van een individu rat, kan een draad top nodig zijn op de kooi tijdens de training om ontsnapping te voorkomen. Ondanks de individuele variabiliteit, hebben we met succes gebruik gemaakt van deze protocol op een verscheidenheid van stammen en leeftijden om geluiden ten opzichte van de uitgangswaarde elke individuele rat te verbeteren.

Ratten zijn gevoelig voor ogenschijnlijk kleine veranderingen in de omgeving, zoals geuren, temperatuur, en personeel. Een inspanning moet worden gedaan om geparfumeerde producten voor persoonlijke verzorging, zoals lotions, haarproducten, en parfums te voorkomen. Voordat u opleiding, moet een individu comfortabel interactie met en de behandeling ratten. Bovendien kan inconsistenties in personeel of omgeving van invloed op de ratten 'vocalisatie reactie.

Omdat de ratten zijn nachtdieren, moeten ze worden bijgehouden op een reversed lichtcyclus om voor opleidingen te laten plaatsvinden tijdens de donkere deel van hun cyclus, wanneer ze het meest actief zijn. We verlichten onze training kamer met rode lichten. Bovendien, als een beloning water wordt gebruikt tijdens de opleiding, moeten ratten hebben beperkte toegang tot water. Onze ratten zijn water beperkt gedurende 21 uur voorafgaand aan de training. Drie uur van de blootstelling aan water werd bepaald door onze Institutional Animal Care en gebruiken comite om de minst beperkende periode die mag water nuttig als versterking te zijn in onze gedragsstudies zonder presenteren van een substantieel gevaar voor de diergezondheid of het welzijn worden. Ratten krijgen toegang tot water op willekeurige tijden (10 minuten tot 30 minuten) na de training en vervolgens vrije toegang tot water hebben drie uur tijdens de donkere deel van hun licht cyclus. Ratten moeten worden geïnspecteerd dagelijks op tekenen van uitdroging en gewogen om de andere dag om ervoor te zorgen is er geen significant (meer dan 10%), gewichtsverlies. Een voedingsmiddel restrictie is niet nodig bij gebruik van een levensmiddel te behandelen als een beloning. Behandelt die specifiek zijn voor ratten zijn commercieel verkrijgbaar, maar we hebben een klein stukje van een zoete ontbijtgranen om een ​​effectieve beloning.

Zoals hierboven vermeld, vrouwelijke ratten in estrus lokken een hogere vocalization reactie van mannen dan niet-seksueel ontvankelijk vrouwtjes. Door het handhaven van een groot aantal van de vrouwen in de kolonie, is er een grote kans dat opten minste een vrouw zal zijn in estrus op een bepaalde dag. Kan echter ook estrus farmacologisch worden geïnduceerd in vrouwelijke ratten door subcutaan injecteren van 10 ug van β-estradiol in 0,1 cc steriele sesamolie 48 uur voorafgaand aan de opleiding, gevolgd door 500 ug van progesteron in 0,1 cc steriele sesamolie 4 uur voor de training. Bovendien moeten mannelijke ratten, die naïef aan vrouwelijke ratten seksueel voorafgaand aan de vocale training ervaren. Dit wordt bereikt door het plaatsen van een vrouwelijke rat die tekenen van seksuele ontvankelijkheid (darten, lordose, oor kronkelen) vertoont in het huis van de man kooi totdat de mannelijke mounts en ejaculeert. Mannen kunnen niet monteren tijdens de eerste paar sessies en het vrouwtje kan worden verwijderd na het mannelijke interesse toont in de vrouwelijke door snuiven en / of achter de vrouwelijke rond de kooi. Seksueel ervaren is een keer per dag gedaan voor twee weken. Deze periode biedt ook de mogelijkheid voor ratten te wennen aan de experimentator (s) en opname ruimte.

Een beperking van deze methode is de subjectieve bepaling van de vocalisatie type. Daarnaast is deze factor beperkt de snelheid van het verzamelen van gegevens, zoals elk gesprek moet onafhankelijk worden onderzocht en handmatig ingedeeld. In verband hiermee is het belang van het hebben van ervaren beoordelaars, die de juiste wijze is opgeleid in vocalisatie identificatie. Zowel intra-en interbeoordelaarsbetrouwbaarheid moet worden bezien binnen uw eigen lab.

Samengevat, zijn ultrasone vocalisaties in knaagdieren gebruikt in vele verschillende modellen van de hersenen-gedrag relaties, met inbegrip van emotionele toestanden, beloning en verslaving, en ziekte staten, zoals autisme studie. ^6,14-16 deze nieuwe methode is een manier om de studie mechanismen die ten grondslag liggen aan gerichte vocale training voor de behandeling van spraak-tekorten in veroudering en ziekte van Parkinson. Deze methode heeft de potentie om worden toegepast op andere ziekte-modellen, die de communicatie en spraak beïnvloeden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA	Avisoft BioAcoustics	40011
UltraSoundGate 116Hb	Avisoft BioAcoustics	41161
Avisoft-RECORDER	Avisoft BioAcoustics	10201
Avisoft-SASLab Pro	Avisoft BioAcoustics	10101